Insel-Assay: Eine High-Throughput-Methode zur Bewertung des Drosophila-Lokomotor-Verhaltens

- Der Insel-Assay besteht aus einer erhöhten weißen Plattform in einem Tablett aus Seifenwasser, bedeckt durch eine transparente Box mit einer offenen Seite. Eine Kamera auf der Oberseite der Box zeichnet Overhead-Bilder der Plattform auf, und Lichter werden platziert, um eine gleichmäßige Ausleuchtung des Bereichs zu gewährleisten.

Um die Fliegen auf der Arena zu laden, tippen Sie auf eine Durchstechflasche gegen eine flache Oberfläche, um alle Fliegen auf den Boden zu bringen. In schneller Folge entfernen Sie den Fläschchenstecker, drehen Sie die Durchstechflasche um und tippen Sie auf das offene Ende der Durchstechflasche auf die Plattform, um alle Fliegen gleichzeitig auszuschlagen.

Die Probanden sind auf die Box beschränkt, und diejenigen, die auf dem Seifenwasser landen, tauchen schnell unter, weil Seife die Oberflächenspannung des Wassers verringert. Um das Verhalten des Bewegungsapparates unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen, zählen Sie die verbleibenden Fliegen nach einem festgelegten Zeitraum auf der Plattform.

In diesem Beispielprotokoll sehen wir eine Einrichtung des Insel-Assays, der mit der halbautomatischen Bildanalyse kompatibel ist.

- Zuerst bereiten Sie mindestens drei Fläschchen pro Versuchszustand als biologische Repliken. Jede Durchstechflasche sollte etwa 15 Fliegen des gleichen Geschlechts und ähnlichen Alters enthalten. Wichtig ist, dass die Fliegen intakte Flügel haben müssen.

Erstellen Sie die Ordner, um die Experimente zu speichern. Generieren Sie diese in einer Verzeichnisstruktur, die durch die Bedingungen definiert ist und repliziert. Wenn das Experiment zum Beispiel zwei Genotypen mit jeweils fünf Replikationen hat, erstellen Sie einen Hauptordner mit dem Datum des Experiments, und erstellen Sie innerhalb dieses Ordners einen Unterordner für jeden Genotyp. Erstellen Sie dann innerhalb der Genotypordner Unterordner für jede Replikation.

Als nächstes stellen Sie das Prüfgerät auf. Fügen Sie kaltes Wasser mit einer kleinen Menge Seife in das Bad tablett und positionieren Sie die Plattform in der Mitte des Bades, wenn sie nicht bereits im Bad befestigt ist. Bedecken Sie das Tablett und die Plattform mit einer transparenten Box.

Um die Plattform zu beleuchten, positionieren Sie eine kühle Lampe, wie gewöhnliche 12-Volt-LEDs, darüber. Positionieren Sie auch eine Webcam, die mit einem Computer direkt über der Plattform verbunden ist.

Öffnen Sie auf dem Computer die Bildaufnahmesoftware. Wählen Sie im Menüsystem die entsprechende Webcam als Aufnahmegerät aus. Platzieren Sie eine tote Fliege auf der Insel, um die Videoeinstellungen anzupassen. Optimieren Sie helligkeit, Kontrast und Farbe in der Software, so dass die tote Fliege schwarz vor einem weißen Hintergrund erscheint.

Als nächstes passen Sie die Zeitraffer-Film-Setup, um die Filme als AVI-Dateien zu speichern. Dann navigieren Sie zu dem Verzeichnis, wo die Daten gespeichert werden sollen und definieren Sie den Namen des Films. Speichern Sie diese Änderungen.

Für die Komprimierung der Bilddaten wählen Sie den Intel IYUV-Code. Stellen Sie die Aufnahmegeschwindigkeit alle 0,1 Sekunden auf einen Frame ein und passen Sie die entsprechende Wiedergaberate auf 10 Bilder pro Sekunde an.

Gehen Sie schließlich zur Einstellung Erweitert und wählen Sie Erstellen eines BNP-Images für jeden erfassten Frame aus. Navigieren Sie dann zu demselben Verzeichnis, das Sie zum Hosten der AVI-Dateien ausgewählt haben, und drücken Sie OK.

Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass die Insel leer und sauber ist. Dann starten Sie die Aufnahme in der Zeitraffer-Bildschnittstelle der Bildaufnahme-Software.

Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit Fliegen und tippen Sie zwei- oder dreimal darauf, alle Fliegen nach unten zu klopfen. Dann entfernen Sie schnell den Stecker aus der Durchstechflasche und tippen Sie kräftig auf die Fliegen auf die Plattform. Sie sollten alle ungefähr zur gleichen Zeit auf die Plattform treffen.

Geben Sie den Fliegen bis zu 30 Sekunden, um die Plattform zu verlassen. Dann stoppen Sie die Aufnahme. Bei Bedarf entfernen Sie alle verbleibenden Fliegen manuell von der Plattform.

Bevor Sie mit dem nächsten Experiment fortfahren, müssen Sie sicher sein, das Verzeichnis neu zu definieren, in dem der nächste Datensatz gespeichert werden soll.