Screening per le modifiche genomiche: un metodo per identificare i mutanti generati da CRISPR in Drosophila

- Quando gli embrioni iniettati si sviluppano in adulti G0, attraversare tutte le singole mosche verso scorte di bilanciere adatte per espandere le potenziali linee modificate F1 CRISPR ed essere in grado di tenere traccia dell'ereditarietà della modifica genomica. Quindi, attraversare maschi singoli F1 scelti casualmente a femmine bilanciatrici adatte per essere in grado di recuperare la prole se un maschio di F1 è positivo alla mutazione. Una volta che la croce ha preso, trasferire il maschio F1 in un tubo per lo screening.

Per estrarre il DNA genomico, schiacciare la mosca con una punta di pipetta contenente tampone di estrazione. Una volta scomposto il tessuto, espellere il liquido. Il tampone di estrazione contiene proteinasi K, un enzima che digerisce le proteine nel campione e viene inattivato dal calore elevato.

Ora che il DNA è accessibile, procedere allo screening PCR. Ad esempio, utilizzare primer progettati per amplificare una regione che include la nuova sequenza. Solo in presenza della modifica il secondo primer si lega e un prodotto PCR viene amplificato. Nell'esempio, vedremo le mosche allevate e vagliate dalla PCR per l'inserimento di una sequenza di transattivazione che sostituisce il primo esone del gene branchless.

- Quando gli embrioni nos-Cas9 precedentemente iniettati sia con il plasmide di espressione dell'RNA guida che con il donatore sostitutivo si sviluppano in adulti, cross G0 vola individualmente al bilanciatore vola da una linea appropriata per l'allele mirato. Anestetizza la prole F1 da ogni croce G0 su un cuscinetto di anidride carbonica e scegli casualmente da 10 a 20 maschi al microscopio stereo. Incrocia individualmente ogni maschio selezionato con una femmina di bilanciatore da una linea appropriata per l'allele mirato.

Quando le larve di F2 si schiudono, scegliete il padre F1 da ogni croce. Estrarre il DNA genomico schiacciando ogni mosca per 10-15 secondi con una punta di pipetta contenente 50 microlitri di tampone di schiacciamento senza erogare il tampone. Quindi, erogare il buffer rimanente nel tubo e mescolare bene.

Incubare a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi in un blocco termico di 95 gradi Celsius per 1-2 minuti per inattivare la proteinasi K. Dopo aver filato per 5 minuti a 10.000 volte g, conservare la preparazione a 4 gradi Celsius per ulteriori analisi PCR.

Eseguire schermate basate su PCR in tre minuti utilizzando primer forward 1 e reverse 1 sullo schermo per l'esistenza dell'inserimento o della sostituzione. Eseguire PCR utilizzando primer forward 2 e reverse 2 per verificare l'inserimento o la sostituzione da tre regioni prime. Eseguire PCR utilizzando primer M13F e invertire 3 per controllare l'HDR end-in.

- Mantenere le linee di volo con l'HDR finale confermato e stabilire scorte di equilibrio della generazione F2. Out cross the balancer vola di nuovo per rimuovere eventuali mutazioni indesiderate su altri cromosomi.