Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- 注入された胚がG0成人に発達すると、すべての個々のハエを適切なバランサ株に渡って潜在的なF1 CRISPR編集ラインを拡大し、ゲノム修飾の継承を追跡することができます。
ゲノムDNAを抽出するには、抽出バッファーを含むピペットチップでハエを押しつぶす。組織が分解されたら液体を排出し、抽出バッファーにサンプル中のタンパク質を消化する酵素であるプロテナーゼKが含まれ、高熱によって不活性化される酵素。
DNAにアクセスできるようになったので、PCRスクリーニングに進みます。例えば、新しい配列を含む領域を増幅するように設計されたプライマーを使用します。改変の存在下でのみ2番目のプライマーが結合し、PCR産物が増幅されます。
- 以前にガイドRNA発現プラスミドと代替ドナーの両方を注射したnos-Cas9胚が成人に発達すると、G0が個別に飛んで標的となるアレレに適したラインからバランサフライを行います。
F2幼虫が孵化したら、各十字架からF1の父親を選び、各フライを50マイクロリットルのスクッシュバッファを含むピペットチップで10〜15秒間押しつぶしてゲノムDNAを抽出し、残りのバッファをチューブに分配してよく混ぜます。
20〜30分間摂氏37度でインキュベートします。インキュベーションに続いて、チューブを95°Cのヒートブロックに1〜2分間置いてプロテナーゼK.を不活性化し、10,000グラムで5分間回転した後、さらにPCR分析のために摂氏4度で調製物を保存します。
挿入または置換の存在をスクリーニングするためにプライマーフォワード1とリバース1を使用して3段階PCRベースのスクリーンを実行します。
- 確認されたエンドアウトHDRでフライラインを維持し、F2世代からのバランスストックを確立します。アウトは、他の染色体上の意図しない突然変異を取り除くために再び飛ぶバランサを横切ります。
