Dissezione della ghiandola linfatica larvale: isolamento dell'organo produttore di emociti Drosophila

- La ghiandola linfatica larvale Drosophila melanogaster è responsabile della produzione di emociti, o cellule del sangue, che circolano nell'emolinfa larvale. Per identificare la ghiandola linfatica, trovare prima il vaso dorsale, o cuore, che pompa l'emolinfa in tutto il corpo. Seguire il vaso dorsale verso la testa fino a trovare il cervello. La ghiandola linfatica è una piccola struttura a più lobi accanto al cervello, che fiancheggia il vaso dorsale.

Per trovare il lobo primario, identificare il lobo più grande della ghiandola. Questo lobo contiene tre zone, definite da diversi stadi di sviluppo degli emociti. La zona midollare più vicina al vaso dorsale contiene emociti immaturi, mentre la zona corticale contiene emociti maturi. All'estremità posteriore del lobo primario, è possibile trovare il centro di segnalazione posteriore, composto da emociti specializzati. I lobi secondari e terziari sono più piccoli e non hanno zone definite.

Per sezionare la ghiandola linfaca, avrai bisogno di un microscopio sezionante, due forcep per manipolare le larve e una soluzione salina tamponata.

In questo esempio, sezioneremo ghiandole linfatiche per l'uso in immunoistochimica.

- Per iniziare la dissezione della ghiandola linfatica, aggiungere 1 millilitro di 1x PBS a 1 pozzo di una piastra da 24 pozzetti per ogni impostazione sperimentale da sezionare. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento usa e getta, aggiungere 1 goccia di PBST dello 0,1% a ciascun pozzo. Posizionare la piastra piatta sul ghiaccio. Posizionare un cuscinetto di sezionamento pulito su una base stereomicroscopica illuminata. Utilizzare una pipetta di trasferimento usa e getta per posizionare una goccia dello 0,01% di PBST sul pad.

Trasferire una larva nella goccia PBST per la dissezione. Tenere la lava con un paio di forcep, lato dorsale verso l'alto, circa 1/4 di lunghezza dall'estremità posteriore. Con il secondo paio di forcep, afferrare la cuticola immediatamente anteriore alla prima coppia e tirare delicatamente la cuticola larvale verso la parte anteriore, fino a quando i ganci della bocca sono esposti.

Rilasciare la cuticola e utilizzare entrambe le pinza per bisettare la larva. Rimuovere l'estremità posteriore dalla goccia PBST e scartare. Fissare la cuticola per la stabilità, quindi utilizzare la seconda coppia di pinza per afferrare i ganci della bocca esposti e estrarli delicatamente. In questo modo la cuticola verrà separata dalle strutture interne.

Tenere in mano i ganci della bocca, rimuovere con cura le strutture indesiderate, come le ghiandole salivari, il corpo grasso e l'intestino. Raccogliere delicatamente il complesso tissutale sezionato dai ganci della bocca e trasferirlo in un pozzo del piatto sul ghiaccio. Ripetere la dissezione con tutte le larve desiderate, ma non superare un tempo di dissezione di 30 minuti prima di procedere alla fase di fissazione.

Per iniziare il montaggio dei tessuti, posizionare una goccia di tampone di montaggio su uno scivolo di vetro. Utilizzando i ganci per la bocca come maniglia, trasferire la ghiandola linfatico nella goccia tampone. Spaziare i tessuti in modo uniforme, diffondendo il tampone di montaggio nel processo.

Far scorrere con cura una pinta delle pinie sotto il vaso dorsale, tirando delicatamente verso la periferia del tampone di montaggio per estrarre e appiattire la ghiandola linfaca. Con un movimento di segatura, tagliare il vaso dorsale tra la ghiandola linfaica e il cervello. Spostare il resto dei tessuti dalla ghiandola linfatico al bordo più esterno del tampone.

Si prenda un coperchio pulito e lo si abbassa con cura sul tampone di montaggio. Le diapositive sono ora pronte per l'imaging o possono essere conservate a 4 gradi Celsius fino a quando necessario.