Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Die Drosophila melanogaster Larvenlymphe ist für die Produktion von Hämozyten verantwortlich, oder Blutzellen, die in der Larvenhämolymphe zirkulieren. Um die Lymphdrüse zu identifizieren, finden Sie zuerst das Rückengefäß, oder Das Herz, das Hämolymphe im ganzen Körper pumpt. Folgen Sie dem Dorsalgefäß zum Kopf, bis Sie das Gehirn finden.
Um den Primärlappen zu finden, identifizieren Sie den größten Lappen der Drüse. Dieser Lappen enthält drei Zonen, die durch verschiedene Stadien der Hämozytenentwicklung definiert sind. Die medulläre Zone, die dem Dorsalgefäß am nächsten liegt, enthält unreife Hämozyten, während die kortikale Zone reife Hämozyten enthält. Am hinteren Ende des Primärlappens befindet sich das hintere Signalzentrum, das aus spezialisierten Hämozyten besteht.
Um die Lymphdrüse zu sezieren, benötigen Sie ein Sezieren des Mikroskops, zwei Zangen, um die Larven zu manipulieren, und eine gepufferte Saline-Lösung.
In diesem Beispiel werden wir Lymphdrüsen für den Einsatz in der Immunhistochemie sezieren.
- Um mit der Lymphdrüsensektion zu beginnen, fügen Sie 1 Milliliter 1x PBS zu 1 Brunnen einer 24-Well-Platte für jede zu sezierte Versuchseinstellung hinzu. Dann, mit einer Einweg-Transferpipette, fügen Sie 1 Tropfen von 0,1% PBST zu jedem Brunnen hinzu. Legen Sie die Platte flach auf Eis. Legen Sie ein sauberes Sezieren pad auf eine beleuchtete Stereomikroskopbasis. Verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette, um einen Tropfen von 0,01% PBST auf das Pad zu legen.
Übertragen Sie eine Larve auf den PBST-Tropfen zur Zerlegung. Halten Sie die Lava mit einem Paar Zangen, dorsale Seite nach oben, ca. 1/4 Länge vom hinteren Ende. Mit dem zweiten Paar Zangen, greifen Sie die Nagelhaut sofort vor dem ersten Paar und ziehen Sie sanft die Larvencuticle in Richtung der vorderen, bis die Mundhaken ausgesetzt sind.
Lassen Sie die Nagelhaut los und verwenden Sie beide Zangen, um die Larve zu zerlegen. Entfernen Sie das hintere Ende aus dem PBST-Tropfen und entsorgen Sie. Setzen Sie die Nagelhaut für Stabilität und dann verwenden Sie das zweite Paar Zange, um die ausgesetzten Mundhaken zu greifen und sie vorsichtig herauszuziehen.
Halten Sie die Mundhaken, entfernen Sie sorgfältig unerwünschte Strukturen, wie die Speicheldrüsen, Fettkörper, und Darm. Nehmen Sie vorsichtig den sezierten Gewebekomplex durch die Mundhaken und übertragen Sie es auf einen Brunnen der Platte auf Eis. Wiederholen Sie die Sezieren mit so vielen Larven wie gewünscht, aber nicht überschreiten eine 30-minütige Sezierzeit, bevor Sie zum Fixierungsschritt.
Um mit der Gewebemontage zu beginnen, legen Sie einen Tropfen Montagepuffer auf einen Glasschlitten. Übertragen Sie die Lymphdrüse mit den Mundhaken als Griff in den Puffertröpfchen. Platzieren Sie das Gewebe gleichmäßig und verteilen Sie dabei den Montagepuffer.
Schieben Sie vorsichtig eine Zange der Zange unter das Rückengefäß, ziehen Sie sanft in Richtung der Peripherie des Montagepuffers, um die Lymphdrüse herauszuziehen und abzuflachen. Schneiden Sie mit einer Sägebewegung das Rückengefäß zwischen lymphad und gehirn. Bewegen Sie den Rest des Gewebes von der Lymphdrüse weg zum äußersten Rand des Puffers.
Nehmen Sie einen sauberen Deckelschlupf und senken Sie ihn vorsichtig auf den Montagepuffer. Die Dias sind nun bildbereit oder können bei 4 Grad Celsius gelagert werden, bis sie benötigt werden.
