维沃的德罗索菲拉 钙成像：神经元活动功能成像方法

- 要在德罗索菲拉神经系统中进行体内钙成像，将基因编码的钙指标（如GCaMP）表达给感兴趣的神经元。当神经元激发行动潜力时，膜的快速去极化会导致电压门钙通道打开，导致细胞外钙大量涌入细胞。

GCaMP是一种融合蛋白，其中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）被修改并融合到N-终点站肌素光链的M13片段和C终点站的钙结合蛋白——卡尔莫杜林。钙与镇定素结合，触发GCaMP的顺从变化，导致蛋白质荧光增加。

要将 GCaMP 荧光的变化图像化为体内神经元活动的代理，请通过预期活动暴露神经系统的区域。然后，使用荧光显微镜，可以捕捉 GCaMP 动态，并配备刺激交付设置。 提供刺激，例如，气味，同时记录GCaMP荧光在响应神经元。

在示例协议中，我们将看到GCaMP 功能成像用于在嗅觉关联学习期间可视化大脑蘑菇体中的反应。

- 要可视化基于GFP 的钙指标，请调谐装有红外激光和水浸目标的多光子显微镜的激光，安装在振动隔离表上，兴奋波长为 920 纳米，并安装 GFP 带传滤波器。 使用粗 Z 调整旋钮，扫描通过大脑的 z 轴来定位大脑感兴趣的区域。使用作物功能将扫描仅聚焦在感兴趣的区域，以最大限度地缩短扫描时间，并旋转扫描视图，使头部前部朝下。 然后，调整框架大小为512 x 512 像素，并选择要扫描的区域，同时考虑每个帧的计算扫描时间，以实现至少 4 赫兹的帧速率。

对于气味唤起的钙瞬态可视化，启动能够连接图像采集软件和气味传递程序的预编程宏封装，并在显微镜软件中开始测量 6.25秒，以建立 F0 基线值。在气味输送系统中，通过点光 LED 指示提供 2.5 秒的气味刺激，由特定气味杯阀的打开和关闭触发，然后在气味偏移结束时记录 12.5秒。然后，以同样的方式重复交付第二和第三个气味。

要在此设置中执行关联调节，请使用计算机控制的气味输送系统呈现条件刺激加气味 60 秒， 以及12个90伏的电击。 休息60秒后，在没有电击的情况下，仅显示条件刺激减去气味60秒。通过在完成训练阶段 3 分钟后重复训练前气味刺激方案，再次测量训练后气味唤起的钙瞬态。然后，以适当的格式保存成像文件，以供以后的图像分析。