Drosophila In Vivo Imagerie calcique : une méthode d’imagerie fonctionnelle de l’activité neuronale

- Pour effectuer l’imagerie in vivo calcium dans le système nerveux de Drosophila, cibler l’expression d’un indicateur de calcium génétiquement codé, tel que GCaMP, aux neurones d’intérêt. Lorsque les neurones déclenchent un potentiel d’action, la dépolarisation rapide de la membrane provoque l’ouverture de canaux calciques à barrière de tension, conduisant à un afflux de calcium extracellulaire dans la cellule.

Le GCaMP est une protéine de fusion dans laquelle la protéine fluorescente verte améliorée, ou EGFP, est modifiée et fusionnée au fragment M13 de la chaîne lumineuse de la myosine au N-terminus, et à la protéine liant le calcium, la calmoduline, au C-terminus. Le calcium se lie à la calmoduline, déclenche des changements de conformation dans le GCaMP, provoquant une augmentation de la fluorescence de la protéine.

Pour ce qui est des changements d’image dans la fluorescence du GCaMP comme indicateur de l’activité neuronale in vivo, exposez la région du système nerveux avec une activité prévue. Ensuite, utilisez un microscope fluorescent qui peut capturer la dynamique du GCaMP et est équipé d’une configuration de livraison de stimulus. Livrer le stimulus, par exemple, une odeur, tout en enregistrant la fluorescence GCaMP dans les neurones répondants.

Dans le protocole d’exemple, nous verrons l’imagerie fonctionnelle de GCaMP être employée pour visualiser des réponses dans les corps de champignon du cerveau pendant l’apprentissage associatif olfactif.

- Pour la visualisation des indicateurs de calcium à base de GFP, régler le laser d’un microscope multiphoton équipé d’un laser infrarouge et d’un objectif d’immersion dans l’eau, installé sur une table d’isolement vibratoire, à une longueur d’onde d’excitation de 920 nanomètres, et installer un filtre à bande GFP. À l’aide du bouton d’ajustement Z grossier, scanner l’axe z du cerveau pour localiser la région du cerveau d’intérêt. Utilisez la fonction culture pour concentrer la numérisation sur seulement la zone d’intérêt pour minimiser le temps d’analyse, et faites pivoter la vue de balayage de telle sorte que l’antérieur de la tête soit orienté vers le bas. Ensuite, ajustez le cadre taille à 512 par 512 pixels et sélectionnez la région à numériser, en tenant compte du temps d’analyse calculé pour chaque image pour atteindre un taux d’image d’au moins 4 Hertz.

Pour la visualisation transitoire du calcium évoquée par l’odeur, lancez un macro package préprogrammé capable de relier le logiciel d’acquisition d’images et le programme de livraison d’odeurs et commencez la mesure dans le logiciel microscope pendant 6,25 secondes pour établir une valeur de référence F0. Dans le système de livraison des odeurs, fournir un stimulus d’odeur de 2,5 secondes, indiqué ici par l’éclairage des LED, déclenchée par l’ouverture et la fermeture de valves de tasse d’odeur spécifiques, suivie de 12,5 secondes d’enregistrement à la fin de la compensation des odeurs. Puis, répéter la livraison pour un deuxième et troisième odorant de la même manière.

Pour effectuer le conditionnement associatif dans cette configuration, utilisez le système de livraison d’odeurs contrôlé par ordinateur pour présenter le stimulus conditionné plus l’odeur pendant 60 secondes, aux côtés de 12 chocs électriques de 90 volts. Après une pause de 60 secondes, présenter le stimulus condition moins l’odeur seul pendant 60 secondes sans choc électrique. Mesurer les transitoires de calcium évoquant l’odeur après l’entraînement à nouveau en répétant le protocole de stimulation des odeurs avant l’entraînement 3 minutes après la fin de la phase d’entraînement. Puis, enregistrer les fichiers d’imagerie dans un format approprié pour une analyse ultérieure de l’image.