Drosophila In Vivo Imaging calcio: un metodo per l'imaging funzionale dell'attività neuronale

- Per eseguire l'imaging in vivo del calcio nel sistema nervoso Drosophila, indirizzare l'espressione di un indicatore di calcio geneticamente codificato, come GCaMP, ai neuroni di interesse. Quando i neuroni sparano un potenziale d'azione, la rapida depolarizzazione della membrana provoca l'apertura di canali di calcio gated di tensione, portando a un afflusso di calcio extracellulare nella cellula.

GCaMP è una proteina di fusione in cui la proteina fluorescente verde potenziata, o EGFP, viene modificata e fusa al frammento M13 della catena luminosa della miosina all'N-terminale, e alla proteina legante il calcio, la calmodulina, al C-terminale. Il calcio si lega alla calmodulina, innesca cambiamenti di conformazione nella GCaMP, causando un aumento della fluorescenza della proteina.

Per visualizzare i cambiamenti nella fluorescenza GCaMP come proxy per l'attività neuronale in vivo, esporre la regione del sistema nervoso con attività prevista. Utilizzare quindi un microscopio fluorescente in grado di catturare la dinamica GCaMP ed è dotato di una configurazione di erogazione dello stimolo. Fornire lo stimolo, ad esempio un odore, durante la registrazione della fluorescenza GCaMP nei neuroni che rispondono.

Nel protocollo di esempio, vedremo l'imaging funzionale GCaMP utilizzato per visualizzare le risposte nei corpi dei funghi del cervello durante l'apprendimento associativo olfattivo.

- Per la visualizzazione degli indicatori di calcio basati su GFP, sintonizzare il laser di un microscopio multifotono dotato di un laser a infrarossi e di un obiettivo di immersione in acqua, installato su una tabella isolata da vibrazioni, a una lunghezza d'onda di eccitazione di 920 nanometri, e installare un filtro passa banda GFP. Utilizzando la manopola di regolazione Z grossolana, eseguire la scansione attraverso l'asse Z del cervello per individuare la regione cerebrale di interesse. Utilizzare la funzione di ritaglio per concentrare la scansione solo sull'area di interesse per ridurre al minimo il tempo di scansione e ruotare la vista di scansione in modo che la parte anteriore della testa sia rivolta verso il basso. Quindi, regolare il fotogramma dimensione a 512 per 512 pixel e selezionare l'area da scansionare, tenendo conto del tempo di scansione calcolato per ogni fotogramma per ottenere una frequenza fotogrammi di almeno 4 Hertz.

Per la visualizzazione transitoria del calcio evocata dall'odore, avviare un pacchetto macro pre-programmato in grado di collegare il software di acquisizione delle immagini e il programma di distribuzione degli odori e iniziare la misurazione nel software del microscopio per 6,25 secondi per stabilire un valore di base F0. Nel sistema di erogazione degli odori, fornire uno stimolo odore di 2,5 secondi, qui indicato dall'illuminazione dei LED, innescato dall'apertura e dalla chiusura di valvole specifiche della tazza di odore, seguito da 12,5 secondi di registrazione alla fine dell'offset dell'odore. Quindi, ripetere la consegna per un secondo e un terzo odore nello stesso modo.

Per eseguire il condizionamento associativo in questa configurazione, utilizzare il sistema di erogazione degli odori controllato dal computer per presentare lo stimolo condizionato più l'odore per 60 secondi, oltre a 12 scosse elettriche da 90 volt. Dopo una pausa di 60 secondi, presentare lo stimolo della condizione meno l'odore da solo per 60 secondi senza scosse elettriche. Misurare nuovamente i transitori di calcio evocato dall'odore post-allenamento ripetendo il protocollo di stimolazione degli odori pre-allenamento 3 minuti dopo aver terminato la fase di allenamento. Quindi, salvare i file di imaging in un formato appropriato per un'analisi successiva dell'immagine.