Levensduuranalyse: Het meten van de levensduur van C. elegans

- Om de gemiddelde levensduur van een nematodenpopulatie te meten, begint u met ontwikkelingsgerichte gesynchroniseerde L1-larven in M9-buffer. Bepaal de dichtheid van de larven en voeg vervolgens 50 toe aan elke plaat. Bereid ten minste drie repliceerplaten per toestand voor, evenals back-upplaten.

Laat deze wormen zich normaal ontwikkelen totdat ze de L4-fase bereiken. Nu kunt u FUdR aan de platen toevoegen, waardoor de wormen geen nakomelingen kunnen produceren. Als alternatief moet u de wormen elke dag na het tellen naar nieuwe platen verplaatsen, om ervoor te zorgen dat u slechts de levensduur van één generatie meet.

Verwijder vervolgens alle mannetjes. Hiermee worden de variabelen van geslacht en paring uit het experiment verwijderd. Tel de volgende dag het aantal levende wormen op het bord door te zoeken naar spontane beweging of reactie op zachte aanraking. Verwijder dode wormen en noteer de aantallen. Tel dagelijks overlevende wormen totdat er geen overblijven. In het voorbeeldprotocol zien we een demonstratie van een levensduurtest.

- Laad de voorbereide met bacteriën bezaaide platen met elk 50 L1-dieren. Zet de platen in een incubator van 20 graden Celsius totdat de embryo's zich ontwikkelen tot de L4-fase. De normale ontwikkeling van L1 tot L4 duurt ongeveer 40 uur.

Voeg vervolgens, om de productie van nakomelingen te voorkomen, 160 microliters van 50x FUdR toe aan elke plaat. Verwijder vervolgens de mannetjes, omdat de levensduur meestal alleen wordt gemeten met hermafrodieten. Eenmaal voltooid, verpakt u de platen opnieuw in de incubator van 20 graden Celsius.

Totdat alle wormen dood zijn, scoor dan dagelijks hun levensvatbaarheid. Raak hiervoor elke niet-bewegende nematode op het hoofd voorzichtig aan met een platinadraad of wimper. Niet-reactieve dieren zijn dood en moeten van de plaat worden verwijderd. Houd rekening met eventuele afwijkingen tijdens deze routine.