Irradiazione UV: Un metodo per integrare array extracromosomiali

- La creazione di array di DNA extracromosomiale per microiniezione, il metodo più semplice per generare ceppi di vermi transgenici, si traduce in elementi genetici che non vengono trasmessi stabilmente durante la divisione cellulare e, quindi, mostrano tassi di ereditarietà variabili e livelli di espressione. L'obiettivo dell'integrazione dell'array in un cromosoma è ridurre questa instabilità genetica e variabilità.

Per fare ciò, inizia con una popolazione sincronizzata con l'età di vermi transgenici L4, che trasportano un array extracromosomiale precedentemente introdotto dalla microiniezione e permettono loro di crescere in adulti gravidi. Trasferire questi adulti in nuove piastre e consentire loro di deporre le uova fino a quando non ci sono almeno 30 uova su ogni piatto. Rimuovere gli adulti e consentire alle uova di crescere fino a raggiungere lo stadio L4. Quindi, irradiare i vermi con luce UV. Ciò causa rotture casuali a doppio filamento nel DNA genomico in cui i meccanismi di riparazione del DNA dei vermi possono incorporare arbitrariamente l'array.

Dopo un periodo di recupero notturno, contare il numero di vermi sopravvissuti. Una piccola percentuale di vermi morti indica un'irradiazione efficiente. Osservare le generazioni successive per isolare le linee transgeniche integrate omozigoti. Nel protocollo di esempio, integreremo un array extracromosomico ad alta velocità di trasmissione che trasporta un marcatore di co-iniezione fluorescente espresso nella faringe.

- Valutare la velocità di trasmissione della linea transgenica da integrare. Per ogni linea transgenica, selezionare 10 adulti gravidi fluorescenti su 10 piastre di coltura separate sotto uno stereoscopio fluorescente. Coltura degli animali in un incubatore di vermi impostato a una temperatura permissiva alla riproduzione dello sfondo genetico.

Monitorare la progenie ogni giorno per valutare quale stadio di sviluppo è espresso e può essere osservato al meglio. Utilizzando la stereoscopia fluorescente, valutate la velocità di trasmissione della progenie determinando la percentuale di progenie fluorescente. Per l'integrazione transgenica, selezionate la linea transgenica con la velocità di trasmissione più elevata.

Ottenere una popolazione di animali transgenici sincronizzati allo stadio larvale L4 per l'integrazione. Selezionare 30 adulti gravidi fluorescenti su cinque piastre di coltura. Dopo che i vermi hanno deposto le uova per tre o quattro ore a 15 gradi Celsius, verificare la presenza di almeno 30 uova per piatto e quindi eliminare gli adulti dai piatti.

Coltura degli animali in un'incubatrice di vermi fino a quando la progenie non raggiunge lo stadio larvale L4. Posizionare ogni piatto contenente da 15 a 20 animali fluorescenti transgenici L4 in un retillo incrociato UV con i coperchi rimossi. Irradiare i vermi.

Per il recupero, incubare i vermi irradiati durante la notte a 15 gradi Celsius. Verificare il numero di animali vivi. Nelle nostre mani, un tasso di sopravvivenza di circa l'80-90% è adattivo per un'irradiazione efficiente. Far crescere gli animali irradiati a 15-25 gradi Celsius fino a quando la progenie non ha raggiunto lo stadio di sviluppo consentendo l'osservazione dell'espressione del marcatore di co-iniezione.