УФ-облучение: метод интеграции экстрахромосомных массивов

- Создание внехромосомных массивов ДНК с помощью микроинъекции - простейшего метода генерации трансгенных штаммов червей - приводит к генетическим элементам, которые не передаются в период деления клеток и, следовательно, демонстрируют переменные ставки наследования и уровни экспрессии. Цель интеграции массива в хромосому состоит в том, чтобы уменьшить эту генетическую нестабильность и изменчивость.

Для этого начните с возрастной синхронизированной популяции трансгенных червей L4, которые несут экстрахромосомный массив, ранее введенный микроинъекции и позволяют им расти в gravid взрослых. Передача этих взрослых на новые пластины и позволяют им откладывать яйца, пока Есть по крайней мере 30 яиц на каждой тарелке. Удалить взрослых и позволить яйца растут, пока они не достигнут стадии L4. Затем, облучение червей с ультрафиолетовым светом.

После ночного восстановительного периода подсчитайте количество выживших червей. Небольшой процент мертвых червей указывает на эффективное облучение. Наблюдайте последующие поколения, чтобы изолировать гомозиготные интегрированные трансгенные линии. В примере протокол, мы интегрируем высокую скорость передачи экстрахромосомного массива с флуоресцентным со-инъекционным маркером, выраженным в глотке.

- Оцените скорость передачи трансгенной линии, которая будет интегрирована. Для каждой трансгенной линии выберите 10 флуоресцентных гравидных взрослых на 10 отдельных пластин культуры под флуоресцентным стереоскопом.

Мониторинг потомства каждый день, чтобы оценить, на какой стадии развития выражен маркер совместной инъекции и может быть лучше всего наблюдается. Использование флуоресцентной стереоскопии, оценить скорость передачи потомства, определив процент флуоресцентного потомства. Для трансгенной интеграции, выберите трансгенную линию с самой высокой скоростью передачи.

Получить популяцию трансгенных животных синхронизированы на этапе L4 личинки для интеграции. Выберите 30 флуоресцентных gravid взрослых на пять пластин культуры. После черви отложили яйца в течение трех-четырех часов при 15 градусах по Цельсию, проверить наличие по крайней мере 30 яиц по тарелке, а затем, устранить взрослых из пластин.

Культура животных в инкубаторе червя, пока потомство не достигнет стадии личинки L4. Поместите каждую пластину, содержащую от 15 до 20 флуоресцентных трансгенных L4 животных в УФ-кросслинкер с крышками удалены.

Для восстановления инкубировать облученных червей на ночь при 15 градусах по Цельсию. Проверьте количество живых животных. В наших руках выживаемость составляет от 80% до 90% адаптивного для эффективного облучения. Расти облученных животных при 15-25 градусах по Цельсию до тех пор, пока потомство не достигло стадии развития, позволяющей наблюдение за экспрессией маркера ко-инъекции.