Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
-जीन के कार्य को निर्धारित करने के लिए एक दृष्टिकोण अपनी अभिव्यक्ति को गिराना और प्रभाव का निरीक्षण करना है। मॉर्फोलिनो ओलिगोमर का उपयोग अक्सर जेब्राफिश में नॉक-डाउन अध्ययन में किया जाता है। एक मॉर्फिनो 25 ठिकानों के आसपास एक सिंथेटिक डीएनए जैसे अणु हैं, जो लक्षित जीन अभिव्यक्ति को रोकता है।
मॉर्फोलिनो उपचार के लिए, एक इंजेक्शन प्लेट पर आंशिक रूप से विच्छेदित पूंछ फिन के साथ एक एनेस्थेटाइज्ड मछली रखें और प्लेट को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। केवल पृष्ठीय पक्ष को इंजेक्ट करें जबकि यूनिजेनेक्टेड वेंट्रल साइड एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। मॉर्फ ओलिनो दो तरीकों से उनके लक्ष्य के आधार पर कार्य कर सकते हैं । सबसे पहले, वे एक mrna पर अनुवाद शुरू साइट को गठबंधन और प्रोटीन संश्लेषण ब्लॉक द्वारा रोकने के ।
दूसरा, यह एक पूर्व-mRNA पर इंट्रोन-एक्सॉन जंक्शन के लिए बाध्य कर सकते हैं और उचित स्प्लिसिंग को रोक सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक दोषपूर्ण प्रतिलिपि जिसे कोशिका द्वारा अपमानित किया जाएगा। बाद में, आउटग्रोथ के लिए कौडल पंखों की जांच करें। मॉर्फोलिनो-उपचारित और अनुपचारित क्षेत्रों के पुनर्विकास के बीच मतभेद ों से संकेत मिलता है कि लक्षित प्रोटीन फिन पुनर्जनन में भूमिका निभाता है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक काउडल फिन पुनर्जनन के हिस्से के रूप में morpholinos का उपयोग करेंगे ।
- मॉर्फोलिनो इंजेक्शन से पहले दिन, 2% agarose के साथ एक इंजेक्शन प्लेट बनाओ कि एक पायदान बाहर अच्छी तरह से एक छोर पर काट दिया है, जो इंजेक्शन प्रक्रिया के लिए मछली को स्थिर करने में मदद मिलेगी । इंजेक्शन लगाने से ठीक पहले, RNAase और DNAase मुक्त पानी में फ्लोरोसीन टैग morpholino को पतला उचित एकाग्रता और यह पांच मिनट के लिए एक ६५ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेट । पहले से तैयार सुई इंजेक्शन लोड और एक कोण पर टिप काट ।
इसके बाद, मछली को एनेस्थेटाइज करें और इसे इंजेक्शन प्लेट पर रखें। सभी अतिरिक्त तरल को हटा दें और प्लेट को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें। सुई को बोनी किरण के लिए बस डिस्टल करें।
सुई को धीरे-धीरे पुनर्योजी ऊतक में डालें, प्रत्येक बोनी किरण के लिए बस डिस्टल करें और ब्लास्टेमा में स्थित होने तक distally धक्का करें। जब सुई सही ढंग से स्थानीयकृत हो, माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम के निर्देशों का पालन करें और प्रति इंजेक्शन मॉर्फोलिनो की पांच नैनोलीटर ड्रॉप इंजेक्ट करें। प्रत्येक इंजेक्शन के साथ, मॉर्फोलिनो समाधान का एक पीला कश देखा जा सकता है, जो इंजेक्शन को ब्लास्टेमा में स्थानीयकृत करने में मदद करता है। मिडलाइन से पृष्ठीय रूप से काम करना, पृष्ठीय पक्ष पर मॉर्फोलिनो प्रति बोनी रे के लगभग 75 नैनोलिटर्स इंजेक्ट करें, जिससे वेंट्रल साइड को इलेक्ट्रोपोरेशन-केवल नियंत्रण के रूप में छोड़ दिया जाता है।
