Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Bir genin işlevini belirlemek için bir yaklaşım, ifadesini yıkmak ve etkisini gözlemlemektir. Morpholino oligomerleri genellikle zebra balıklarında devirme çalışmalarında kullanılır. Morfotin, hedef gen ekspresyonunu engelleyen yaklaşık 25 baz uzunluğunda sentetik dna benzeri bir moleküldür.
Morfotin tedavisi için, kısmen kesilmiş kuyruk yüzgeci olan uyuşturulmuş bir balığı bir enjeksiyon plakasına yerleştirin ve plakayı stereo mikroskop altına yerleştirin. Sadece dorsal tarafı enjekte ederken, sindirilmemiş ventral taraf bir kontrol görevi görür. Morpholinos hedef aldıkları sıraya bağlı olarak iki şekilde çalışabilir. İlk olarak, bir mRNA'daki çeviri başlangıç bölgesine birleşirler ve çeviriyi engelleyerek protein sentezini önlerler.
İkincisi, bir pre-mRNA üzerindeki intron-exon kavşağına bağlanabilir ve uygun birleştirmeyi önleyebilir, hücre tarafından bozulacak kusurlu bir transkript ile sonuçlanır. Daha sonra, kaudal yüzgeçleri büyüme için inceleyin. Morfolino ile tedavi edilen ve işlenmemiş bölgelerin yeniden büyümesi arasındaki farklılıklar, hedeflenen proteinin fin rejenerasyonunda rol oynadığını gösterir. Bu protokolde, kaudal fin rejenerasyon testinin bir parçası olarak morfolinolar kullanacağız.
- Morfotin enjeksiyonundan bir gün önce, kuyunun bir ucunda çentik kesilmiş% 2 agarose ile bir enjeksiyon plakası yapın, enjeksiyon prosedürü için balığı stabilize etmeye yardımcı olacaktır. Enjekte etmeden hemen önce, RNAase ve DNAase serbest suyundaki florosein etiketli morfoinoyu uygun konsantrasyona seyreltin ve beş dakika boyunca 65 santigrat derecelik bir su banyosunda kuluçkaya bırakın. Önceden hazırlanmış bir enjeksiyon iğnesi yükleyin ve ucu bir açıyla kesin.
Daha sonra, balığı uyuşturun ve enjeksiyon plakasına yerleştirin. Tüm fazla sıvıyı çıkarın ve plakayı stereo mikroskop aşamasına yerleştirin. İğneyi sadece kemikli ışına yönlendirin.
İğneyi rejeneratif dokuya hafifçe yerleştirin ve her kemik ışını için sadece distal ve blastema bulunana kadar distal olarak itin. mikroenjeksiyon sistemi yönlerini takip edin ve enjeksiyon başına morfolinonun beş nanolitre damlasını enjekte edin. Her enjeksiyonda, blastemaya enjeksiyonu lokalize etmeye yardımcı olan sarı bir morfinino çözeltisi görülebilir. Orta çizgiden dorsally çalışarak, dorsal tarafta bony ışını başına yaklaşık 75 nanolitre morfolino enjekte ederek ventral tarafı sadece elektroporasyon kontrolü olarak bırakır.
