Overview
प्रोटोकॉल पूंछ में मॉर्फोलिनो इंजेक्शन द्वारा जेब्राफिश में जीन अभिव्यक्ति के लक्षित नॉकआउट का वर्णन करता है ।
Protocol
1. मॉर्फोलिनो इंजेक्शन
- मॉर्फोलिनो को इंजेक्शन लगाने से पहले दिन, एक इंजेक्शन प्लेट(चित्रा 1)बनाएं। अच्छी तरह से एक छोर पर एक पायदान काटना सुनिश्चित करें, जो माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के लिए मछली को स्थिर करने में मदद करता है।
- फ्लोरोसिन-टैग वाले मॉर्फोलिनो को उचित एकाग्रता (1.2 mM से शुरू करने की सलाह) और 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें।
- मॉर्फोलिनो के साथ सुई लोड करें(नोट: इस पर निर्भर करता है कि आप बैक-फिल या फ्रंट-लोड आपकी सुई यह निर्धारित करेगी कि आप पहले सुई लोड करते हैं, या पहले टिप काटते हैं)।
- एक कोण पर सुई से टिप काटें।
- इंजेक्शन प्रति मॉर्फोलिनो के लगभग 5 एनएल बुलबुले को इंजेक्ट करने के लिए अपने माइक्रो-इंजेक्शन सिस्टम के निर्देशों का पालन करें। मॉर्फोलिनो की बड़ी मात्रा ऊतक को बाधित कर सकती है।
- मछली को एनेस्थेटाइज करें और इंजेक्शन प्लेट पर रखें। सभी अतिरिक्त तरल निकालें और सुई को उपयुक्त स्थान पर उन्मुख करें, बस बोनी रे(चित्रा 2)के लिए डिस्टल करें। मॉर्फोलिनो इंजेक्शन (विशिष्ट अभिकर् में की तालिका देखें) के लिए उपयुक्त माइक्रोस्कोप और माइक्रोइंजेक्शन उपकरण का उपयोग करना, आकृति 2 में दिखाया गया है,पूर्वकाल से पीछे तक फिन में मॉर्फोलिनो इंजेक्ट करें। पीछे से पूर्वकाल तक इंजेक्शन लगाने से फिन ऊतक इंजेक्शन के दौरान रोल करने का कारण बनता है और बहुत मुश्किल होता है।
- सुई को धीरे-धीरे पुनर्योजी ऊतक में डालें, प्रत्येक बोनी किरण (चित्र 2में "1" चिह्नित) के लिए डिस्टल करें और ब्लास्टेमा में स्थित होने तक distally पुश करें (चित्र 2 में चिह्नित "2")। पूरे फिन के माध्यम से सुई धक्का नहीं करने के लिए सावधान रहें। जब सुई सही ढंग से स्थानीयकृत हो जाती है, तो मॉर्फोलिनो (यानी एक बार क्लिक करें) इंजेक्ट करें। 1.2 m M पर, फ्लोरोसीन-टैग किए गए मॉर्फोलिनो समाधान सामान्य प्रकाश स्थितियों में भी पीले-हरे दिखाई देते हैं। प्रत्येक इंजेक्शन के साथ, मॉर्फोलिनो समाधान के पीले "पफ" की कल्पना की जा सकती है, जो इंजेक्शन को ब्लास्टेमा में स्थानीयकृत करने में मदद करता है। लगभग 75 एनएल (10-15 क्लिक) मॉर्फोलिनो समाधान के प्रति बोनी रे इंजेक्शन किया जाना चाहिए। क्लिक के बीच ~ 1 सेकंड को रोकें। हम केवल पृष्ठीय पक्ष इंजेक्ट करते हैं, वेंट्रल का उपयोग इलेक्ट्रोपॉरेशन-केवल नियंत्रण के रूप में करते हैं।
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Representative Results
चित्रा 1. ए इंजेक्शन प्लेट का योजनाबद्ध, जो एगर उठे से बना होता है और इसमें मॉर्फोलिनो के माइक्रोइंजेक्शन के दौरान मछली को पकड़ने के लिए एक छोटा सा कुआं होता है।
चित्रा 2। मॉर्फोलिनो माइक्रोइंजेक्शन की योजनाबद्ध। A. मछली को कुएं से बाहर काटे गए पायदान में मछली के सिर के साथ पकवान में रखें, जिससे मछली स्थिर रहने में मदद मिलेगी। B. कम आवर्धन पर, सुई की व्यवस्था करें ताकि यह उच्च आवर्धन पर फिन के पुनरुत्थान ऊतक के करीब हो, प्रत्येक बोनी फिन रे (यानी प्रत्येक ब्लास्टेमा में) को मॉर्फोलिनो डिस्टल इंजेक्ट करें। सुई को बोनी रे (1) के ऊतकों में प्रवेश करना चाहिए, और फिर ब्लास्टेमा (2) के स्थान पर जारी रखना चाहिए। नोट: योजनाबद्ध में हरे घेरे केवल इंजेक्शन के स्थान को दिखाने के लिए होती हैं। morpholino संक्षेप में प्रत्येक इंजेक्शन के बाद एक हरे/पीले "कश" के रूप में कल्पना की जा सकती है; हालांकि, यह योजनाबद्ध में दिखाए गए रूप में जारी नहीं रहता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| Micro-injection pump | World Precision Instruments, Inc. | PV830 | Pneumatic PicoPump Many different microinjection systems could be used |
| Micro-manipulator | World Precision Instruments, Inc. | MMJR | Right-handed (MMJL for lefthanded) |
| Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
| Needle holder | World Precision Instruments, Inc. | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
| Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
