Morpholino Enjeksiyonu: Zebra Balıklarında İşlevi İncelemek İçin Hedef Gen İfadesini Devirme Yöntemi

Overview

Protokol, zebra balıklarındaki gen ekspresyonunun kuyruğa morfosin enjeksiyonu ile hedefli olarak nakavt edildiğini açıklar.

Protocol

1. Morfosin Enjeksiyonu

1. Morfolinin enjekte edilmeden bir gün önce, bir enjeksiyon plakası yapın (Şekil 1). Kuyunun bir ucunda, mikroenjeksiyon prosedürü için balığı stabilize etmeye yardımcı olan bir çentik kestiğinize emin olun.
2. Floresan etiketli morfoinoyu uygun konsantrasyonda seyreltin (1,2 mM ile başlamanızı tavsiye eder) ve 5 dakika boyunca 65 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
3. İğneyi morfoino ile yükleyin(not: iğnenizi geri doldurup doldurmadığınıza veya önden yükleyip yüklemediğinize bağlı olarak, iğneyi önce yükleyip yüklemeyeceğiniz veya önce ucu kesip kesmeyeceğiniz belirleyecektir).
4. İğnenin ucunu bir açıyla kesin.
5. Enjeksiyon başına yaklaşık 5 nl morfinolino kabarcığı enjekte etmek için mikro enjeksiyon sisteminizin talimatlarını izleyin. Daha büyük hacimlerde morfinolino dokuyu bozabilir.
6. Balıkları uyuşturun ve enjeksiyon plakasına yerleştirin. Tüm fazla sıvıyı çıkarın ve iğneyi uygun yere yönlendirin, sadece kemik ışını distal(Şekil 2). Morfotin enjeksiyonları için uygun bir mikroskop ve mikroenjeksiyon aparatı kullanarak (bkz. Belirli Reaktifler Tablosu), şekil 2'degösterildiği gibi morfolini önden posterior'a yüzgecine enjekte edin. Posteriordan ön lige enjekte etmek, enjeksiyon sırasında yüzgeç dokusunun yuvarlanmasına neden olur ve çok zordur.
7. İğneyi rejeneratif dokuya hafifçe yerleştirin, her kemik ışını için sadece distal (Şekil 2'de "1"olarak işaretlenmiştir) ve blastema'da bulunana kadar (Şekil2'de "2" olarak işaretlenmiş) distal olarak itin. İğneyi tüm yüzgecin içinden geçirmemeye dikkat edin. İğne doğru lokalize olduğunda, morfolino enjekte edin (yani bir kez tıklayın). 1,2 mM'de floresan etiketli morfotin çözeltisi normal ışık koşullarında bile sarı-yeşil görünür. Her enjeksiyonda, blastemaya enjeksiyonu lokalize etmeye yardımcı olan morfosin çözeltisinin sarı bir "puf" görselleştirilebilir. Kemik ışını başına yaklaşık 75 nl (10-15 tıklama) morfosin çözeltisi enjekte edilmelidir. Tıklamalar arasında ~ 1 sn duraklatın. Ventral'ı sadece elektroporasyon kontrolü olarak kullanarak sadece sırt tarafına enjekte ediyoruz.

Representative Results

Şekil 1. A. Agarose'dan yapılan ve morfotin mikroenjeksiyonu sırasında balığı tutmak için küçük bir kuyu içeren enjeksiyon plakasının şeması.

Şekil 2. Morfotin mikroenjeksiyon şeması. A. Balıkları, balığın sabit kalmasına yardımcı olacak şekilde kuyudan kesilmiş çentikteki balığın başıyla yemeğe yerleştirin. B. Düşük büyütmede, iğneyi yüzgecin yenileyici dokusuna yakın olacak şekilde düzenleyin. C. Daha yüksek büyütmede, morfotin distalini her kemikli yüzgeç ışınlarına (yani her blastemada) enjekte edin. İğne dokuya kemik ışını (1) distal olarak girmeli ve daha sonra blastemanın bulunduğu yere devam etmelidir (2). Not: Şemadaki yeşil daireler yalnızca enjeksiyonun yerini göstermek içindir. Morfolino, her enjeksiyondan sonra kısaca yeşil / sarı bir "puf" olarak görselleştirilebilir; ancak, bu şemada gösterildiği gibi devam etmez.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino should be custom designed to your protein of interest
Micro-injection pump	World Precision Instruments, Inc.	PV830	Pneumatic PicoPump Many different microinjection systems could be used
Micro-manipulator	World Precision Instruments, Inc.	MMJR	Right-handed (MMJL for lefthanded)
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4	These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle
Needle holder	World Precision Instruments, Inc.	5430-ALL	Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket
Needle puller	Sutter Instrument Co.	P-97	Other micropipette/needle pullers should also work
Microscope	Leica, Nikon, Zeiss	Number varies depending on the manufacturer	Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators
2-Phenoxyethanol	Sigma-Aldrich	77861-1L	Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia