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DNA-Extraktion aus Schwanz Clip

 
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DNA-Extraktion aus Schwanz Clip: Eine Methode in Zebrafisch Genotypisierung verwendet

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- Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie einen anästhesierten erwachsenen Fisch auf einen Stapel saugfähiges Papier legen. Verwenden Sie jetzt eine sterile Rasierklinge, um die Schwanzflosse zu schneiden und den Fisch schnell in einen Tank mit frischem Wasser für die Erholung zu übertragen. Übertragen Sie den Schwanzclip in ein reines Rohr, das einen Lysepuffer enthält. Der Lysepuffer enthält nichtionische Reinigungsmittel, die die Plasmamembran und die Kernmembran einer Zelle löslich machen. Der Puffer enthält auch ein Enzym namens Proteinase K, das Proteine auflöst und die Freisetzung von DNA in das Lysat ermöglicht. Verdauung.

Lassen Sie nun die Röhren mit Schwanzclips über Nacht in einem Inkubator, um das Gewebe bei 55 Grad Celsius bei kontinuierlicher Rotation vollständig abzubauen. Als nächstes erhitzen Sie die Röhre bei 95 Grad Celsius für 15 Minuten, um die Proteinase K zu inaktivieren. Zentrifugieren Sie das Rohr, um unverdautes Material zu pellet und übertragen Sie den überstehenden DNA-haltigen Stoff in eine andere Röhre. Fügen Sie Alkohol hinzu, um die DNA und Zentrifuge wieder auszutreiben, um die DNA in einem Pellet zu sammeln. Im folgenden Protokoll werden wir DNA aus dem Schwanzclip eines erwachsenen Zebrafisches und aus einem ganzen Zebraembryon isolieren.

- Am Tag der DNA-Vorbereitung frische Proteinase K in den Lysepuffer mit einer Konzentration von 1 Milligramm pro Milliliter geben. Gewebe kann von einem erwachsenen Fisch mit einem Flossenclip oder von einem embryonalen Fisch gesammelt werden.

Zuerst befeuchten Sie die Fische in Tricain-Lösung. Warten Sie, bis die Kiemenbewegungen verlangsamen. Dann legen Sie die Fische auf einen Stapel Von Gewebe und schneiden Sie mit einer sterilen Rasierklinge ein kleines Stück der Schwanzflosse etwa 2 bis 3 Millimeter lang. Schnell legen Sie den Fisch in einem markierten Tank mit frischem Wasser für die Erholung.

Nehmen Sie den Flossenclip mit einer sterilen Pipettenspitze auf und übertragen Sie ihn in ein Rohr, das mit hundert Mikrolitern DNA-Lysepuffer gefüllt ist. Achten Sie darauf, sowohl den Panzer des Tieres als auch das Rohr zu beschriften. Bebrüten Sie alle gesammelten Gewebe mindestens vier Stunden und bis über Nacht bei 55 Grad Celsius.

Nach der Inkubation die Proteinase K durch Erhitzen der Rohre bei 95 Grad Celsius für 15 Minuten inaktivieren. Diese Proben sollten sofort für PCR verwendet werden, können aber auch bis zu drei Monate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

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