दो फोटॉन लेजर एक्सोटॉमी: ज़ेब्राफिश भ्रूण में एक्सॉन को घायल करने और एक्सोनल रिकवरी का निरीक्षण करने के लिए एक विधि

- फिनाइल थिओरिया, पीटीयू में ब्याज के भ्रूण रखें, वर्णक गठन को बाधित करने के लिए रिंगर का समाधान, जो निषेचन के बाद 24 घंटे से शुरू होता है। यह विकासशील शरीर रचना विज्ञान को अधिक दिखाई देता है, जो इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक है। एक ट्राइकेन एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण को इमेजिंग चैंबर में स्थानांतरित करें। एक ग्लास स्लाइड को ऊपर रखें और इसे अपने माइक्रोस्कोप के नीचे देखें। अक्षांश पर ध्यान केंद्रित करें घायल होने के लिए, जो एक 488 नैनोमीटर लेजर के तहत दिखाई देता है क्योंकि यह

साइट की इमेज से पहले एक लें। इसके बाद, एक्सॉन को 910 नैनोमीटर लेजर के साथ देखें जो जीएफपी को फ्लोरेसे लाल होने का कारण बनता है। आसपास के ऊतकों को प्रभावित किए बिना लक्ष्य क्षेत्र को घायल करने के लिए इस लेजर की तीव्रता बढ़ाएं। इस प्रक्रिया को एक्सोटॉमी कहा जाता है। एक्सोटॉमी की पुष्टि करने के लिए पहले लेजर के साथ एक नई छवि लें, जो बिखरे हुए मलबे के रूप में दिखाई देता है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम दो फोटॉन लेजर का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में परिधीय संवेदी अक्षों की एक axotomy प्रदर्शन करेंगे ।

- यदि आपकी प्रयोगशाला में दो-फोटॉन स्कोप बनाया गया है, तो Zeiss 510 कॉन्फोसल दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग एक्सॉन को तोड़ने के लिए भी किया जा सकता है। हम घुड़सवार भ्रूण को मंच पर रखकर और 25x पानी के उद्देश्य का उपयोग करके ध्यान में लाते हैं। इसके बाद, दो फोटॉन और आर्गन लेजर को मल्टीट्रैक सेटिंग में चालू करें ताकि एक से दूसरे में स्विच करना संभव हो सके।

हालांकि दोनों लेजर का उपयोग जीएफपी का पता लगाने के लिए किया जाता है, लेकिन दोनों फोटॉन उत्सर्जन को लाल और आर्गन लेजर उत्सर्जन के साथ हरे रंग के साथ कल्पना की जाती है ताकि दोनों को अलग किया जा सके । घायल होने के लिए एक अक्षतं भोग की पहचान करने के लिए आर्गन लेजर का उपयोग करें । जेड सेटिंग्स के तहत पहले और अंतिम ऑप्टिकल वर्गों को चिह्नित करते हैं, एक कॉन्फोकल इमेज लेते हैं, और जेड स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण बनाते हैं ।

आर्गन लेजर को बंद कर दें और दो फोटॉन लेजर को चालू करें. लगभग 9% ट्रांसमिशन की तीव्रता पर स्कैन करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अक्षतंवर अभी भी फोकस में है. स्टॉप बटन पर क्लिक करें ताकि क्रॉप टूल उपलब्ध हो सके. ब्याज के क्षेत्र में ज़ूम करने के लिए क्रॉप का उपयोग करें. आमतौर पर हम लगभग 70x तक ज़ूम करते हैं। एक्सॉन के क्षेत्र को घायल होने के लिए चुनें और इस क्षेत्र को ध्यान में लाएं।

इसके बाद, चैनल टैब के तहत, दोनों फोटॉन की तीव्रता को लगभग 9% ट्रांसमिशन से 15% से 30% ट्रांसमिशन में बदलें। नई सेटिंग्स को एक्टिवेट करने के लिए फास्ट एक्सवाई बटन पर क्लिक करें और फिर क्लिक करें फालतू नुकसान से बचने के लिए जल्दी से रुकें। एक्सॉन को अगर प्रक्रिया काम करती है तो बिखरे मलबे के रूप में देखा जाना चाहिए। अंत में यह सुनिश्चित करने के लिए कि अक्षतंवर वास्तव में क्षतिग्रस्त हो गया था, 488 नैनोमीटर आर्गन लेजर पर वापस स्विच करें। एक और कॉन्फोकल इमेज लें और जेड स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण बनाएं।