Eletrofisiologia do grampo de remendo de células inteiras: um método para estudar propriedades elétricas de neurônios

- Comece colocando uma câmara de gravação contendo uma amostra em uma solução de banho, cuja composição corresponde ao ambiente extracelular fisiológico ou ao citoplasma, em um estágio de microscópio. Avance a micropipette de gravação, uma pipeta contendo um eletrodo de prata banhado em uma solução eletrólito, que imita as condições intracelulares, em direção ao neurônio, aplicando pressão positiva, e faça contato com a membrana celular.

Mude suavemente de pressão positiva para negativa para formar uma vedação apertada entre a membrana e a pipeta. Defina um potencial de retenção no amplificador para manter a célula em uma tensão constante.

Uma vez que a membrana celular se rompe, o potencial de retenção causa o fluxo de íons através de canais de íons fechados de tensão, Criando um potencial de membrana, que é registrado pelo eletrodo de gravação. Registram imediatamente o potencial da membrana. O eletrodo de gravação transmite o sinal para o amplificador de feedback, que subtrai o potencial de membrana do potencial de exploração -- um osciloscópio, que apresenta uma exibição visual do potencial da membrana, e um computador. No protocolo a seguir, realizaremos uma medição de grampo de remendo na célula Mauthner em um embrião de zebrafish.

- Para se preparar para a fixação do patch, comece puxando algumas pipetas de grampo de remendo com vidro borossilicato de parede fina em um puxador horizontal. Os diâmetros da ponta pipeta têm cerca de 0,2 a 0,4 micrômetros após o polimento do fogo para uma borda lisa, e o afunilador da haste tem cerca de 4 milímetros de comprimento.

Encha a ponta da pipeta com solução intracelular mergulhando a ponta no fluido intracelular. Em seguida, insira uma agulha de seringa na pipeta e expulse suavemente a solução intracelular da seringa para terminar de encher a pipeta. Coloque a pipeta no estágio da cabeça do amplificador na configuração da eletrofisiologia. É importante manter o estágio da cabeça em um ângulo de aproximadamente 45 graus ao eixo horizontal, pois isso garante um ângulo de entrada para a pipeta adequada para a formação de vedações de alta resistência com a célula Mauthner.

Logo antes da pipeta baixar para a solução do banho, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta para reduzir a chance de bloqueio da ponta. Continue a se aproximar da célula M com uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta. A pressão positiva empurra suavemente a célula de um lado para o outro, e quando posicionada imediatamente sobre a célula, forma uma pequena covinha na membrana celular.

Agora, deixe a pipeta no lugar por alguns segundos para limpar suavemente a superfície celular para que uma vedação forte entre a pipeta e a membrana possa ser formada. Em seguida, solte a pressão positiva na pipeta para iniciar o selo. Uma pequena quantidade de pressão negativa, juntamente com o potencial de pipeta negativa, resulta em selos giga-ohm formando-se em poucos segundos.

Posteriormente, altere o potencial de retenção no amplificador para menos 60 milivolts. Ruptura da membrana celular com uma série de pulsos curtos de sucção.

A resistência ao acesso deve ser monitorada a cada 30 segundos a um minuto, e se houver uma mudança de 20% ou mais, aborte o experimento. Uma vez que o experimento tenha terminado e dados suficientes tenham sido adquiridos, sacrifique o embrião removendo o cérebro traseiro com um par de fórceps.