Электрофизиология цельноклеточного патча: метод изучения электрических свойств нейронов

- Начните с размещения камеры записи, содержащей образец в растворе ванны, состав которого соответствует физиологической внеклеточной среде или цитоплазме, на стадии микроскопа. Предварительный запись микропипетта, пипетки, содержащей серебряный электрод, купаемый в электролитном растворе, который имитирует внутриклеточные условия, к нейрону, применяя положительное давление, и ввести контакт с клеточной мембраной.

Аккуратно переключитесь с положительного на отрицательное давление, чтобы сформировать плотное уплотнение между мембраной и пипеткой. Установите потенциал удерживания на усилителе для поддержания клетки при постоянном напряжении. Затем разоряйте клеточную мембрану в микропипюте, применяя всасывание.

После разрыва клеточной мембраны, удерживаемый потенциал вызывает поток ионов через ионные каналы, закрытые напряжением, создание мембранного потенциала, который регистрируется записывающим электродом. Немедленно записываем мембранный потенциал. Записывающий электрод передает сигнал усилителю обратной связи, который вычитает мембранный потенциал из удерживающих потенциалов - осциллоскоп, который представляет визуальное отображение мембранного потенциала, и компьютер.

- Чтобы подготовиться к зажиму патча, начните с потянув некоторые патч зажим пипетки с тонкостенными борозиликат стекла в горизонтальном шкиве. Pipette кончик диаметром около 0,2 до 0,4 микрометра после полировки огня до гладкого края, и хвостовик конус составляет около 4 миллиметров в длину.

Заполните наконечник пипетки внутриклеточным раствором, окунув кончик во внутриклеточную жидкость. Затем вставьте шприц-иглу в пипетку и аккуратно изгоните внутриклеточный раствор из шприца, чтобы закончить заполнение пипетки. Прикрепите пипетку к этапу головы усилителя в электрофизиологической установке. Важно держать головную сцену под углом примерно 45 градусов к горизонтальной оси, так как это обеспечивает угол входа для пипетки, которая подходит для формирования уплотнений высокого сопротивления с клеткой Маутнера.

Прямо перед тем, как пипетка опустится в раствор ванны, нанесите небольшое количество положительного давления на пипетку, чтобы уменьшить вероятность блокировки кончика. Продолжайте подходить к M-клетке с небольшим количеством положительного давления в пипетке. Положительное давление мягко толкает клетку из стороны в сторону, а при расположении непосредственно над клеткой образует небольшую ямочки на клеточной мембране.

Теперь оставьте пипетку на месте на несколько секунд, чтобы аккуратно очистить поверхность клетки так, чтобы образовалась сильная печать между пипеткой и мембраной. Затем отпустите положительное давление в пипетку, чтобы инициировать уплотнение.

Впоследствии измените удерживательский потенциал в усилителе до минус 60 милливольт. Разрыв клеточной мембраны с серией коротких импульсов всасывания. Затем сразу записывают мембранные потенциалы и минимизируют артефакты емкости.

Устойчивость к доступу должна контролироваться каждые 30 секунд до минуты, и если происходит изменение на 20% или более, прервать эксперимент.