Electrofisiología de abrazadera de parches integrales: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

- Comenzar colocando una cámara de grabación que contenga una muestra en una solución de baño, cuya composición coincida con el entorno extracelular fisiológico o el citoplasma, en una etapa de microscopio.

Cambie suavemente de presión positiva a negativa para formar un sello apretado entre la membrana y la pipeta. Establezca un potencial de sujeción en el amplificador para mantener la célula a un voltaje constante.

Una vez que la membrana celular se rompe, el potencial de retención causa el flujo de iones a través de canales de iones cerrados por voltaje, Crear un potencial de membrana, que es grabado por el electrodo de grabación. Inmediatamente grabar el potencial de membrana. El electrodo de grabación transmite la señal al amplificador de retroalimentación, que resta el potencial de membrana del potencial de retención- un osciloscopio, que presenta una visualización visual del potencial de la membrana, y una computadora.

- Para prepararse para la sujeción de parches, comience por tirar de algunas pipetas de abrazadera de parche con vidrio borosilicato de paredes delgadas en un extractor horizontal. Los diámetros de la punta de pipeta son de aproximadamente 0,2 a 0,4 micrómetros después de que el fuego se pula a un borde liso, y la inclinación del vástago es de aproximadamente 4 milímetros de largo.

Llene la punta de la pipeta con solución intracelular sumergiendo la punta en el fluido intracelular. A continuación, inserte una aguja de jeringa en la pipeta y expulse suavemente la solución intracelular de la jeringa para terminar de llenar la pipeta. Conecte la pipeta a la etapa de la cabeza del amplificador en la configuración de electrofisiología.

Justo antes de que la pipeta baje en la solución de baño, aplique una pequeña cantidad de presión positiva a la pipeta para reducir la probabilidad de bloqueo de la punta. Continúe acercarse a la célula M con una pequeña cantidad de presión positiva en la pipeta. La presión positiva empuja suavemente la célula de lado a lado, y cuando se coloca inmediatamente sobre la célula, forma un pequeño hoyuelo en la membrana celular.

Ahora, deje la pipeta en su lugar durante unos segundos para limpiar suavemente la superficie celular para que se pueda formar un sello fuerte entre la pipeta y la membrana.

Posteriormente, cambie el potencial de retención en el amplificador a menos 60 milvoltios. Romper la membrana celular con una serie de pulsos cortos de succión.

La resistencia al acceso debe controlarse cada 30 segundos a un minuto, y si hay un cambio del 20% o más, abortar el experimento. Una vez finalizado el experimento y se han adquirido suficientes datos, sacrificar el embrión quitando el freno trasero con un par de fórceps.