Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Börja med att placera en bit benvax i två cellkulturplattor märkta som test och kontroll. Pipett en lämplig mängd bioluminescens som uttrycker bröstcancerceller vid varje tallrikscentrum och inkuberar plattorna under en viss tid för att underlätta celltillsatsen. Placera en liten benexplanta på benvaxet i testplattan och säkra det genom att applicera tryck.
Häll långsamt ett cellkulturmedium med fetala nötkreatursserum, ett tillväxttillskott, till varje tallrikssida för att dränka explanten och inkubera vid 37 grader Celsius under en viss varaktighet. Benvävnaden i testplattan släpper lösliga faktorer, såsom cytokiner och SRC-kinas, som lockar bröstcancerceller, vilket resulterar i deras migration. Tillsätt ett substrat på varje platta och placera plattorna på en bioluminescenstomografikammare.
Cancercellen som uttrycker bioluminescerande protein oxiderar substratet och avger ljus. Kvantifiera spridningen genom att mäta totala fotoner som avges av varje cell med hjälp av programvaran. Cancerceller i testplattan ska föröka sig snabbare än cellerna i kontrollplattan. I följande protokoll kommer vi att samkultur bröstcancerceller intill lårben explanter för att mäta bröstcellsproliferation.
För detta experiment, förbered en bröstcancercellsupphängning med 100 000 celler per 50 mikroliter DMEM plus 10% FBS. Förbered dessutom pluggar av benvax för immobilisering av benfragmenten. Förvara pluggarna i en petriskål med hjälp av de avskurna ändarna på en mikropipettspets. Överför sedan pluggarna med tång till en sexbrunnsplatta och använd en steril handske, tryck pluggarna i 12-läget.
Därefter, pipett 50 mikroliter av cellupphängningen i mitten av varje brunn. Placera plattan i en vävnadskulturinkubator i 45 minuter för att främja celltillsatsen. Medan plattan inkuberar, extrahera benfragmenten. Med cellerna fästa på plattan, placera benvävnadsfragmenten på benvaxet i 3 brunnar och tryck ner var och en med rongeuren. Tre brunnar utan fragment fungerar som kontroller.
Lägg sedan långsamt till fem milliliter DMEM plus 10% FBS till väggen i varje brunn. Benvaxet och benfragmenten får inte rubbas. Inkubera sedan kulturen i 20 till 24 timmar. Nästa dag, avbilda cellerna. Tillsätt först 300 mikrogram per milliliter luciferin till varje brunn och avbilda sedan omedelbart plattan med en IVIS-bildplattform.
