Overview
Denna video beskriver odlingen av bröstcancerceller intill lårben explanter för att mäta cancer cell spridning och kolonisering i en mänsklig benvävnad explant modellsystem.
Protocol
1. Samkulturerade bröstcancerceller intill benfragment för att mäta bröstcellsproliferation med BLI
- Före försöket, förbered en suspension som innehåller 2 x 105 bröstcancerceller/50 μl och förbered pluggar av benvax för immobilisering av benfragment i kulturen. Skär en P200 mikropipettespets i 3 stycken och använd den smala änden av den största biten på ett "cookie cutter" sätt för att skära små (~ 35 mg) bitar av benvax. Använd den breda änden av den minsta biten för att mata ut benvaxpluggarna i en Petri-skål för förvaring.
- Placera en bit benvax vid 12-tidens läge i varje brunn och tryck försiktigt ner med ett sterilt handskfinger.
- Pipett 50 μl cellupphängning som innehåller 1 x 105 bröstcancerceller i DMEM-10% FBS + Pen-Strep i mitten av varje brunn på en 6-brunnsplatta. (Alternativt såddceller i ett spridda mönster om så önskas.) Placera plattan i en 37 °C vävnadskulturinkubator i 45 minuter för att främja celltillsatsen.
- Placera 1 benfragment på 1 bit benvax för varje experimentell brunn och applicera försiktigt tryck med rongeuren för att säkra den. Utför experiment i tre exemplar så att 3 benfragment från ett givet THR-prov placeras i de tre bästa brunnarna, medan de tre nedre brunnarna endast innehåller benvax som kontroller.
- Använd en 5 ml pipett och leverera försiktigt och långsamt 5 ml DMEM-10% FBS till sidan av varje brunn för att undvika att rubba bröstcellerna eller benfragmenten. Placera plattan i en 37 °C vävnadskulturinkubator i 20-24 timmar.
- För att utföra bioluminescensavbildning (BLI) ta bort plattan från inkubatorn och tillsätt luciferinsubstrat (för att uppnå en koncentration på 300 μg/ml) till varje brunn. Avbilda plattan omedelbart på en IVIS Imaging Platform med hjälp av följande parametrar: f-stop på 1, liten binning, exponeringstid på 1 sek, nivå D. Mät signalintensiteten för varje brunn samt genomsnittlig utstrålning (fotoner/andra/kvadratcentimeter/steradian).
- Använd bildframställningsprogram för att definiera regioner av intresse (ROI) för att kvantifiera den genomsnittliga utstrålningen för alla experimentella brunnar och kontrollbrunnar. Exportera genomsnittliga utstrålningsvärden till ett Excel-blad för att utföra statistik och generera diagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/ Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 |
