Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Aşağıdaki yöntem, seçilen bitki genleri üzerindeki spesifik kromatin modifikasyonlarının güvenilir ve hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. İlk olarak, modifiye edilmiş histonları ve DNA'yı formaldehit ile çapraz bağlayın. Daha sonra, modifikasyona özgü antikorlarla immünopresipitasyonu kolaylaştırmak için kromatini çıkarın ve sonikleştirin.

Son olarak, histon DNA komplekslerinin ve gene özgü gerçek zamanlı kantitatif PCR'nin cüruf bağlanmasıyla çip reaksiyonunu analiz edin. Bitkilerde bu yaklaşım, labirentte C dört fotosentezi ile ilişkili spesifik histon modifikasyonları ve Arabidopsis'te sistemik bağışıklık gibi moleküler bilgiler sağlayabilir. Kromatin immünopresipitasyonunun Mars spektrometresi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu tekniklerin bitki genomuna seçilen diziler üzerindeki histon modifikasyonlarının tespit edilmesine izin vermesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü protokol, doğru performansı prosedürün başarısının anahtarı olan birkaç adım gerektirir. Bu videoda, model bitki Arabidopsis ANA'da gen ekspresyonunun serbestleştirilmesine ilişkin içgörü sağlamak için çip analizini kullanıyoruz ve prosedürü gösteren bir doktora öğrencisi olan mic yakovich olacak Her numune için iki gram arabidopsis yaprağı ve 50 mililitrelik bir plastik tüp hasadı ile başlayın. 40 mililitrelik işareti çapraz bağlama tamponu ile doldurun ve yaprakların suya daldırılmasını sağlamak için tampon yüzeyinin hemen üzerine özel bir filtre süngeri yerleştirin.

Şimdi, numuneleri vakumlu bir kuruluğa koyun ve 10 dakika süzün. Çapraz bağlanma reaksiyonunu durdurmak için 2.5 mililitre iki molar glisin ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Sonra beş dakika tekrar sızın, vakumlamaya devam edin, beş dakika daha sızın.

Daha sonra yaprakları bir elek üzerinde hasat ederken sıvıyı atın. Yaprakları plastik bir beherde bir litre su ile iki kez yıkadıktan sonra, yaprakları kağıt havluyla iyice kurulayın, yaprakları taze bir plastik tüpe toplayın ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Numuneleri kromatin izolasyonuna kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Sıvı nitrojen soğutmalı bir havan ve havaneli kullanarak, donmuş numuneleri ince bir toz haline getirin. Tozu 50 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın. Tozu 30 mililitre bir numaralı ekstraksiyon tamponunda askıya alın ve bir üst çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Süspansiyonu dört kat ayna bezinden 50 mililitrelik yeni bir plastik tüpe geçirin. Santrifüjlemeden sonra SUP natin'i atın. Ardından, peleti iki numaralı 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse etmek için bir boya fırçası kullanın, ardından 950 mikrolitre ekstraksiyon tamponu daha ekleyin.

İkincisi, süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir mikro füj tüpüne aktarın ve 10 dakika santrifüjleyin. Bu arada, 1.5 mililitre ekstraksiyon tamponu içeren iki mililitre mikro füj tüpü hazırlayın. Üç numara.

Daha sonra, peleti 300 mikrolitre ekstraksiyon tamponunda kademeli olarak askıya almak için süpernatanları atın. Üç numara. İlk olarak, küçük bir tampon hacmi ekleyin.

Üç numara, peleti bir boya fırçası ile askıya alın ve ardından kalan tamponu ekleyin. Şimdi numuneleri dikkatlice 1.5 mililitre ekstraksiyon tamponunun hazırlanan tüplerinin üzerine yerleştirin. Üçüncüsü, iki fazın santrifüj numunelerini dört santigrat derecede 16.000 kez G'de bir saat boyunca karıştırmamasını sağlamak.

Supnatini atın ve kromatin peletini 300 mikrolitre sonikasyon tamponu sonikat kromatininde bir boya fırçasıyla yaklaşık 400 baz çiftinin DNA boyutuna kadar askıya alın. Sonikat olduğunda, kromatinin yaklaşık 30 santigrat derecenin üzerinde ısıtılmayacağından emin olun. Isıya duyarlı çapraz bağları korumak için, çözülmemiş materyali çökeltmek için sonikat örneğini santrifüjleyin ve süpernatanı protein agaroz ve antikor bağlama tamponu içeren iki mililitrelik mikro füj tüplerine hasat edin.

200 mikrolitre numune kromatin preparatını ekleyin. Tüpleri bir üst çalkalayıcı üzerinde bir saat inkübe edin. Santrifüjlemeden sonra, numune süpernatantlarını hasat edin ve 30 mikrolitre protein alın.

Giriş malzemesinin kromatin konsantrasyonunun belirlenmesi için taze 1.5 mililitrelik tüplere bir aros. Sonikasyonlu kromatinin 40 mikrolitresini rezerve edin. Daha sonra, 30 mikrolitre protein arosuna 400 mikrolitre sonikasyonlu kromatin süspansiyonu ekleyin ve uygun miktarda modifikasyona özgü antikor, dört santigrat derecede bir üst çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edin.

Boncukları 440 kez G'de iki dakika boyunca inceltme ile hasat edin. Süpernatanı çıkarın ve bir üst çalkalayıcı üzerinde ilgili tamponun 900 mikrolitresi ile art arda 10 dakikalık boncuk peletleri yıkayın. Son yıkamadan sonra, kalan tamponu tamamen çıkarın. DNA'yı histonlardan kurtarmak için, boncuklara 400 mikrolitre D çapraz bağlama tamponu ekleyin ve daha önce girdaptan beş dakika santrifüj numunesi için korunan 40 mikrolitre giriş numunesi ekleyin ve gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin.

Şimdi, DNA'yı ticari bir DNA saflaştırma kiti ile saflaştırın ve geleneksel lokusa özgü gerçek zamanlı kantitatif R-T-P-C-R gerçekleştirin. Bu örnekte, Arabidopsis ANA PR iki savunma geninin ekspresyonu, bitki hormonu salisilik asidin sentetik bir analoğu olan Benzo Diaz ole tarafından indüklendi. Sonuçlar, PR iki ekspresyonunun aktivasyonunun, PR iki promotörü üzerindeki histonlar H üç ve H dört üzerindeki lizin kalıntılarının asetilasyonundaki bir artış ile ilişkili olduğunu göstermektedir.

Bu prosedürü denerken, yaprak tozuna bir ekstraksiyon tamponunun eklenmesinin kapalı fcon tüpünde aşırı basınca neden olduğunu hatırlamak önemlidir. Lütfen tüpü arada bir açmayı unutmayın. Ayrıca, bir sonraki tamponu eklemeden önce peletlerin askıya alınmasından sonra boya fırçasını çıkarmamayı unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, kromatinin rolü ve modifikasyonları hakkındaki temel soruları yanıtlamak için DNA ve histonların aldehit bazlı çapraz bağlanması, kromatin immünopresipitasyonunun izolasyonu ve lokusa özgü DNA kantitasyonunun form oluşturduğu hisone modifikasyonlarının ve düz kaldıraçların nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız.