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광학 현미경 검사를위한 조직 학적 샘플 준비
 
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광학 현미경 검사를위한 조직 학적 샘플 준비

Overview

조직학은 일반적으로 가벼운 현미경의 사용에 의해 원조되는 세포와 조직의 연구입니다. 조직학적 시료의 제조는 계획된 염색 기술 또는 기타 다운스트림 응용 프로그램을 포함하는 예상 후처리뿐만 아니라 크기 및 경도와 같은 샘플의 고유 특성에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 바와 같이, 시편 제제는 전형적으로 사망 시 세포에 의해 방출되는 자연발생효소에 의한 시료의 분해를 방지하기 위한 고정 절차로 시작한다. 일단 수정되면 샘플을 충분히 지원할 수 있는 임베딩 매체에 샘플을 배치합니다. 가장 일반적으로 이것은 파라핀 왁스이지만 글리세린 기반 동결 매체 및 한고와 같은 다른 물질도 단면화 중에 시료를 둘러싸고 있습니다. 단면은 사용자가 몇 미크론에서 두께에 몇 밀리미터에 이르기까지 얇은 조각으로 샘플을 면도 할 수 있도록 마이크로 톤 또는 다른 절단 장치에서 일어난다. 절단되면, 섹션은 유리 슬라이드에 장착하고 현미경에 이미지되기 전에 샘플의 특정 기능을 가지고 스테인드.

Procedure

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조직학은 조직과 세포의 현미경 해부학의 연구를 참조 하는 용어. 가벼운 현미경 검사법에 대한 적절한 조직학적 샘플 준비는 조직 샘플에서 품질 결과를 얻기 위해 필수적입니다.

거의 모든 조직학적 절차에 공통된 3가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 시료는 조직을 보존하고 조직 저하를 늦추기 위해 고정된다. 다음으로, 샘플은 자체와 유사한 기계적 특성을 가지는 재료 또는 포함 매체에 침지됩니다. 일단 내장되면, 샘플은 마이크로토메로 알려진 정확한 절단 도구를 사용하여 얇은 조각으로 단면, 또는 절단된다. 이 비디오에서는 이러한 일반적인 단계와 이와 관련된 몇 가지 개념에 대해 설명합니다.

조직 고정은 세포 와 조직 구성 요소를 보존하고 구조를 유지하는 중요한 단계입니다. 세포 사멸 후, 자연적으로 발생하는 효소는 세포 세포세포로부터 방출되고 세포 및 세포 외 매트릭스 전체의 단백질을 저하시켜 세포의 구조를 파괴하기 시작합니다. 고정은 이러한 효소의 능력을 직접 억제하여 단백질을 소화하고 효소 분열 부위를 인식할 수 없게 함으로써 이러한 분해를 방지합니다.

고정의 두 가지 주요 메커니즘은 교차 연결 및 응고입니다. 교차 연결은 단백질 내와 그(것)들 사이 둘 다 공유 결합 형성을 관련시킵니다, 조직을 뻣뻣하게 하고 그러므로 저하에 저항하는 원인이 되는. 응고는 단백질 고등 구조를 변형시키는 알코올 이나 아세톤의 사용을 통해 단백질의 탈수에 의해 발생, 그래서 소수성, 또는 물 두려워, 영역 단백질 표면을 이동. 응고적 고정은 파라핀 왁스와 같은 미디어를 포함시켜 조직을 관통하는 데 도움이 될 수 있습니다.

가장 일반적으로 사용되는 고정제 중 하나는 물에 용해 된 포름알데히드인 포르말린입니다. 고정 하는 동안, 포름알데히드는 기본 아민에 연결, 아미노산 리신과 글루타민의 측면 사슬에서 발견 하는 것과 같은 메틴 다리 라는 안정적인 크로스 링크를 형성 하기 위해. 이 프로세스는 본질적으로 느리며 최대 1-2 일이 걸릴 수 있습니다.

수정하기 전에 몇 가지 고려 사항이 이루어져야 합니다. 먼저 샘플의 확산성을 고려하십시오. 고정재는 시간의 제곱근을 곱한 고정물의 확산 계수와 관련된 속도로 조직을 통해 거리를 확산시합니다. 시료에 1mm를 침투하는 데 1시간이 걸리는 고정은 5mm를 관통하는 데 25시간이 소요됩니다. 포르말린이 조직의 중심에 도달하면 교차 연결 반응 틀이 발생해야합니다. 따라서, 샘플 크기는 적당한 시간에 철저한 고정을 위해 두께4mm로 제한되어야 한다.

둘째, 고정의 볼륨과 pH를 고려하십시오. 시약이 시간이 지남에 따라 쉽게 고갈되지 않도록 표본 대 표본 볼륨 비율은 적어도 40:1이어야 합니다. 일부 고정제는 산성 pH에서 작동하도록 설계되었지만, 포르말린은 중성 pH를 유지하기 위해 인산염으로 버퍼링할 때 가장 잘 작동하므로 과잉 산이 생성되지 않아 조직에서 유물을 유발합니다.

조직학적 제제의 다음 단계는 표본 자체와 유사한 기계적 강성을 가진 매체의 표본을 지원하는 것을 포함하는 포함입니다. 너무 뻣뻣하거나 너무 약한 경우 단면화하는 동안 결함이 발생할 수 있기 때문에 올바른 포함 매체를 선택하는 것이 중요합니다. 지금까지, 포함에 사용되는 가장 일반적인 미디어는 파라핀 왁스입니다.

파라핀 을 포함하기 전에, 견본은 에탄올로 조직의 물을 대체하여 탈수되어야 합니다, 첫째, xylenes 다음, 그리고 마지막으로 파라핀 왁스를 따뜻하게 합니다. 왁스가 시료에 침투하면 조심스럽게 배치되고 금형을 사용하여 블록을 형성하기 위해 추가 왁스로 둘러싸여 있습니다. 다음으로, 샘플은 단면화를 위한 조직 카세트에 부착됩니다.

단면은 임베딩 블록에서 샘플의 얇은 조각을 절단하는 과정입니다. 단면도는 일반적으로 가벼운 현미경 검사법과 함께 사용하기 위하여 4-10 μm 의 순서에 있습니다.

단면을 자르기 위해 금속, 유리 또는 다이아몬드 블레이드가 먼저 마이크로톤에 고정됩니다. 그런 다음 샘플이 샘플 홀더에 배치됩니다. 다음으로, 샘플은 절단 표면으로 진보하고 원하는 두께의 조각을 만들기 위해 블레이드를 가로 질러 그려집니다. 단면은 유리 슬라이드에 배치 할 수있는 얇은 리본으로 축적됩니다.

단면에 따라 샘플이 슬라이드에 배치됩니다. 파라핀 임베디드 샘플의 경우, 슬라이스는 먼저 따뜻한 수조에 넣고 물에서 밀어 내고 건조할 수 있습니다.

생물학적 조직은 내재된 대조가 거의 없으므로 조직학 후 슬라이드는 일반적으로 형태학 이나 특정 단백질을 강조하는 염료 또는 항체로 얼룩져 있습니다. 가장 일반적인 얼룩은 헤마톡시린과 에신 또는 H&E입니다. 너무 흔하기 때문에 많은 자동화 기계가 H&E. Hematoxylin이 세포의 핵을 파란색으로 얼룩지게 하고 세포균 분홍색이 조직의 세포 형태를 드러내는 것을 얼룩지게 하기 위해 만들어졌습니다.

고정에 한 가지 단점은 단백질의 교차 연결 그들의 결합 사이트를 찾기 위해 항체를 라벨에 대 한 더 많은 만들 수 있습니다. 견본을 보존하기 위하여 고정을 사용하는 대신, 조직의 급속한 동결, 또는 스냅 동결은 극저온절이라는 단면 기술 뒤에 이용될 수 있습니다

조직 샘플은 OCT라는 특수 동결 매체에 내장되고 지향되거나 최적의 절삭 온도 매체를 한 다음 빠르게 동결됩니다. 다른 포함 매체와 마찬가지로 OCT는 샘플의 강성과 일치합니다.

냉동 마이크로 톤 또는 냉동성, 냉동 섹션을 절단하는 데 사용되며,이 악기는 절단 블레이드와 샘플을 냉각 유지하기 위해 -20 ° C의 내부 온도를 유지합니다. 파라핀 임베디드 섹션과 는 달리, 냉동 섹션은 단면 직후 양전하 유리 슬라이드에 직접 들어올릴 수 있습니다.

고정을 방지하는 또 다른 방법은 시가 가루를 포함시키는 것입니다. 아가로즈가 식으면 조직을 제자리에 고정시키고 과도한 아가로즈를 잘라버릴 수 있습니다.

마이크로톤에 대한 또 다른 대안인 진동은 아가로즈 에베디드 샘플을 진동하고 이동하는 블레이드를 가지고 있습니다. 비브로토메는 아가로즈 임베디드 샘플로부터 50-1000 μm의 순서에 두꺼운 섹션을 만드는 데 사용됩니다.

샘플은 일반적으로 염색하기 전에 아가로즈에서 제거된 다음, 진공 그리스와 같은 물질로 둘러싸인 슬라이드에 배치되어 덮개 슬립이 시료를 스퀴싱하지 못하게 합니다. 그들은 각 두꺼운 섹션의 고해상도 이미지를 얻기 위해 공초점 현미경 검사를 사용하여 가장 잘 볼 수 있습니다.

당신은 단지 가벼운 현미경 검사법에 대한 조직학적 샘플 준비에 JoVE의 비디오를 보았다.

이제 조직 조각에서 염색 가능한 섹션으로 당신을 얻기 위해 샘플 준비에 관련된 단계를 이해해야합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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