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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Separazione delle proteine con SDS-PAGE

Overview

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, o SDS-PAGE, è una tecnica ampiamente utilizzata per separare miscele di proteine in base alle loro dimensioni e nient'altro. SDS, un detergente anionico, viene utilizzato per produrre una carica uniforme attraverso la lunghezza delle proteine che sono state linearizzate. Caricandole prima in un gel a base di poliacrilammide e poi applicando un campo elettrico al gel, le proteine rivestite di SDS vengono quindi separate. Il campo elettrico agisce come forza motrice, attirando le proteine rivestite SDS verso l'anodo con proteine più grandi che si muovono più lentamente rispetto alle piccole proteine. Al fine di identificare le proteine in base alle dimensioni, gli standard proteici di dimensioni note vengono caricati insieme ai campioni e vengono eseguiti nelle stesse condizioni.

Questo video presenta un'introduzione a SDS-PAGE spiegando prima la teoria alla base e successivamente dimostrando la sua procedura passo-passo. Vengono discussi vari parametri sperimentali, come la concentrazione di poliacrilammide e la tensione applicata al gel. Vengono introdotti metodi di colorazione a valle come Coomassie e macchie d'argento e vengono presentate variazioni del metodo, come l'elettroforesi su gel 2D.

Procedure

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SDS-PAGE è una tecnica utilizzata da molti ricercatori per separare miscele di proteine in termini di dimensioni. Il completamento con successo di questa tecnica è un primo passo essenziale per molti metodi di analisi delle proteine, come l'immunoblotting. Di per sé, è uno strumento utile per valutare le dimensioni e la purezza delle proteine.

Per comprendere la tecnica SDS-PAGE, è necessario prima comprenderne i componenti principali. SDS-PAGE è l'acronimo di Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis. Il solfato di sodio-dodecile, la prima parte di questo, o "SDS", è un detergente anionico. Ciò significa che è composto da un gruppo idrofilo con una carica negativa netta e una lunga catena idrofoba con carica neutra.

La catena idrofobica copre le proteine in proporzione alla loro massa ad una velocità di 1,4 grammi di SDS per grammo di proteine. Ciò fornisce alle proteine la forza motrice necessaria per la separazione guidata dalle dimensioni in un campo elettrico.

L'elettroforesi su gel di poliacrilammide utilizza un idrogel a base di poliacrilammide. La poliacrilammide è un polimero che forma una matrice molto regolare attraverso la quale le proteine possono muoversi. Più concentrato è il gel, più lentamente le proteine lo attraverseranno quando esposte a un campo elettrico. Il processo di utilizzo di un campo elettrico spazialmente uniforme per influenzare il movimento di un oggetto è noto come elettroforesi.

SDS-PAGE viene eseguito su proteine isolate da molte fonti diverse tra cui cellule in coltura, tessuti, sangue, urina e lievito.

Le proteine provenienti da queste varie fonti devono prima essere separate da altri componenti cellulari utilizzando tecniche tra cui l'omogeneizzazione e la centrifugazione, spesso seguite dall'uso di tamponi di lisi.

Una volta che la proteina è isolata, la sua concentrazione viene spesso misurata, per garantire un carico uguale di campioni, confrontando la quantità di proteine nel campione con gli standard di albumina in un test colorimetrico di acido bicinchoninico o BCA.

Un passo importante da ricordare è l'aggiunta del buffer di caricamento. Il buffer di caricamento ha 3 funzioni principali. In primo luogo, grazie alla SDS e ad agenti riducenti aggiuntivi, denatura le proteine, il che significa fondamentalmente che trasforma strutture proteiche complesse in una catena lineare di amminoacidi. In secondo luogo, contiene glicerina, che assicura che il campione non galleggi via quando viene caricato nei pozzi del gel. Infine, la maggior parte dei buffer di carico commerciali include un colorante, come il blu bromofenolo, che può essere monitorato per misurare l'avanzamento della fase di elettroforesi.

Dopo aver aggiunto il buffer di caricamento, i campioni devono essere miscelati e quindi bolliti per 5 minuti. Ciò consente di rompere i forti legami di solfuro nelle proteine con l'aiuto di un agente riducente come il beta-mercaptoetanolo. Una volta che tutti i legami disolfuro sono rotti, la SDS può rivestire più uniformemente le proteine.

Successivamente, i campioni vengono rapidamente filati verso il basso e sono quindi pronti per essere caricati nel sistema di gel per l'elettroforesi.

Prima che i campioni possano essere caricati, il sistema di gel deve prima essere assemblato. Questo inizia con l'acquisto o la fabbricazione di un gel di poliacrilammide. I gel prefabbricato stanno diventando sempre più popolari perché l'acrilimide è neurotossica e può causare danni cerebrali. La cassetta di gel contiene pozzi che vengono utilizzati per caricare i campioni.

Una volta che i gel sono fissati in posizione, le camere interne ed esterne vengono riempite con un tampone che contiene la stessa concentrazione di ioni utilizzata per produrre i gel. Questo crea un circuito elettrico che passa senza soluzione di continuità dal catodo, attraverso il gel e nell'anodo.

Successivamente, le scale a peso molecolare vengono in genere caricate nel gel, seguite dai campioni. Mentre il gel corre, la scala si diffonderà e creerà bande proteiche visibili di dimensioni note. Nelle fasi finali, queste bande possono essere utilizzate per calcolare le dimensioni di ciascuna proteina.

Una volta caricati tutti i campioni, i terminali positivi e negativi sulla scatola di gel sono collegati a una fonte di alimentazione in grado di mantenere una tensione costante per un lungo periodo di tempo. I gel vengono in genere avviati a circa 60 V fino a quando l'intero campione non è entrato nella regione del gel chiamata "gel impilabile". Quindi, la tensione viene aumentata a circa 200 V per 30 minuti a 1 ora a seconda delle dimensioni e della concentrazione del gel e delle dimensioni della proteina di interesse.

Quando l'elettroforesi è completa, la cassetta viene rimossa e aperta per esporre il gel. Il gel può quindi essere colorato con una tipica macchia proteica, come la macchia blu coomassie o argento, per visualizzare le bande proteiche all'interno del gel. La macchia di Coomassie può rilevare bande con un minimo di 50 nanogrammi di proteine, mentre la macchia d'argento può rilevare bande con un minimo di 1 nanogrammo di proteine.

Nell'elettroforesi su gel bidimensionale, i campioni sono separati da due proprietà separate sui gel, una dimensione alla volta. In primo luogo, i campioni vengono caricati e disposti in base ai loro punti isoelettrici su strisce di gradiente di pH localizzate. Le proteine nella striscia vengono quindi denaturate e vengono poste sopra un tipico gel di poliacrilammide dove vengono fissate in posizione con una soluzione di gel fresco. Quindi, la separazione della seconda dimensione viene eseguita da SDS-PAGE.

Mentre la messa a fuoco isoelettrica non è l'unica opzione per l'elettroforesi su gel 2D, è la più comune. L'elettroforesi su gel bidimensionale è uno strumento inestimabile che fornisce informazioni sui complessi proteici e sull'organizzazione dei sub-organelli.

Dopo aver eseguito il gel, un passo successivo molto comune è quello di trasferire le proteine dal gel su una membrana in PVDF o nylon per l'analisi. È quindi possibile utilizzare anticorpi specifici per sondare la membrana e cercare proteine di interesse. Qui sono mostrati i tipici risultati immunoblot in cui il ricercatore ha utilizzato 3 diverse tecniche di amplificazione del segnale per determinare quale mostra meglio la presenza della proteina Pit-1 in una serie di diluizioni seriali.

Hai appena visto il video di JoVE sulla separazione delle proteine usando SDS-PAGE. Ora dovresti capire i passaggi coinvolti nella risoluzione di una proteina in termini di dimensioni usando questa potente tecnica. Come sempre, grazie per aver guardato!

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