Overview
Transfecção é o processo de inserção de material genético, como DNA e RNA duplo encalhado, em células de mamíferos. A inserção do DNA em uma célula permite a expressão, ou produção, de proteínas usando as próprias máquinas das células, enquanto a inserção do RNA em uma célula é usada para reduzir a produção de uma proteína específica, parando a tradução. Enquanto o local de ação para o RNA transfeinado é o citoplasma, o DNA deve ser transportado para o núcleo para transfecção eficaz. Lá, o DNA pode ser transitoriamente expresso por um curto período de tempo, ou ser incorporado ao DNA genômico, onde a mudança é transmitida de célula para célula à medida que se divide.
Este vídeo descreve o básico por trás das transfecções mediadas químicas e introduz alguns dos reagentes mais usados, incluindo lipídios carregados, polímeros e fosfato de cálcio. Cada passo é descrito a partir da preparação das células para transfecção através da análise da eficiência da transfecção. Além disso, a seção de aplicações deste artigo em vídeo descreve o uso de eletroporação e uma transfecção biolística como métodos alternativos para introduzir ácido nucleico em células mamíferas. Ele também descreve um uso avançado de transfecção onde a co-transfecção de RNA e DNA interferem são introduzidas como uma maneira de regular uma proteína natural e, ao mesmo tempo, produzir uma variante mutante dela dentro da mesma célula.
Procedure
Transfecção é o processo de inserção de material genético, como DNA e RNA duplo encalhado, em células de mamíferos. A inserção do DNA permite a expressão, ou produção, de proteínas usando as próprias máquinas das células. Considerando que a inserção de RNA de duplar encalha é usada para interromper a produção de uma proteína específica, interrompendo a tradução. Esta poderosa ferramenta permitiu aos pesquisadores estudar melhor a função genética e a expressão, a função proteica e as mutações genéticas.
Nenhum reagente ou método de transfecção única funciona para todos os tipos de células. Felizmente, muitos métodos e reagentes foram desenvolvidos nas últimas décadas para facilitar a transfecção de uma grande variedade de células. Esses métodos podem ser separados em dois grupos principais: transfecções químicas e físicas.
Neste vídeo, vamos focar nos diferentes sistemas de entrega química, pois eles se tornaram cada vez mais comuns nos últimos anos. Esses métodos incluem abordagens baseadas em lipídios, transfecção mediada por fosfato de cálcio e o uso de polímeros cônicos para citar alguns.
O princípio subjacente de todos os métodos de transfecção química são semelhantes. Todos eles fazem uso de moléculas portadoras carregadas positivamente que se complexam com ácidos nucleicos para empacotá-los para entrega celular. Essas moléculas portadoras superam a carga negativa da barreira celular-membrana que lhes permite passar pela membrana para entregar seu conteúdo.
Na transfecção lipídica, lipídios cáticos formam um lipossomo que se combina com ácidos nucleicos para formar um "complexo de transfecção". Enquanto fosfato de cálcio simplesmente condensa o DNA e dá-lhe uma carga positiva líquida. Além disso, polímeros cônicos como a polielegina condensam o DNA em partículas positivamente carregadas.
O próximo passo na transfecção mediada química é a fixação dos complexos carregados positivamente à membrana celular carregada negativamente através de simples atração eletrostática.
Em seguida, o complexo entra na célula através da endocitose - um processo pelo qual as moléculas entram na célula através de vesículas ligadas à membrana chamadas endosários.
Uma vez dentro da célula, os ácidos nucleicos devem escapar do endossomo por um processo que ainda é desconhecido. Uma vez fora do endosomismo, os ácidos nucleicos se encontrarão no citoplasma da célula e, finalmente, no núcleo, onde o maquinário da célula é capaz de fazer mRNA e, em seguida, proteína a partir dele. O citoplasma é o local de ação para o pequeno RNA interferindo, ou siRNA, onde reduz a produção de proteína interferindo em uma parte do maquinário produtor de proteínas da célula.
DNA transfectado pode existir de forma estável ou transitória. Transfecções estáveis ocorrem quando o DNA transfectado é introduzido no genoma e, portanto, persiste à medida que a célula se divide. Transfecções transitórias ocorrem onde o DNA não é incorporado ao genoma e a expressão da proteína codificada é perdida durante um período de cerca de 24-96 horas.
A eficiência da transfecção de DNA é tipicamente medida através de sistemas de repórteres que estão amarrados ao gene inserido. São sistemas que podem ser facilmente detectados, seja observando diretamente a própria proteína repórter, como no caso da proteína fluorescente verde, seja por sua medição de sua atividade enzimática usando um ensaio colorimétrico, como no caso de um repórter enzimático de luciferase. A transfecção estável do DNA é melhor medida por análise genômica, como o RT-PCR.
Para medir o sucesso do silenciamento do siRNA, os níveis de proteína direcionados em cada amostra podem ser determinados pelo Immunoblot. A transfecção bem-sucedida do siRNA deve diminuir a expressão da proteína alvo dentro das células, enquanto os níveis do gene de limpeza, GAPDH, permanecem estáveis.
Para maximizar a eficiência da transfecção, as células devem ser mantidas no crescimento da fase de registro e estar entre 40 e 80% confluentes, no momento da transfecção. Para conseguir isso, as células da cultura devem ser colhidas no dia anterior... Contado... e semeada em uma placa multi-poço em uma concentração que produzirá o nível correto de confluência no momento da transfecção.
Em seguida, os reagentes químicos e ácidos nucleicos são misturados e dado tempo para formar os complexos nucleicos ácido-reagente. Para cada sistema de entrega química, as concentrações específicas de cada componente devem ser otimizadas.
Os complexos nucleicos ácido-reagente são então adicionados às células banhadas e incubados muitas vezes durante a noite para dar tempo de sobra para os complexos se conectarem às células e mediarem a transfecção. Após 24 horas, a mídia deve ser removida e substituída por novas mídias culturais.
Existem muitas variações e aplicações de transfecção. A co-transfecção pode permitir que um pesquisador estude o efeito de mutações missenses na função das proteínas celulares. Aqui, o RNAi foi transfectado em células HeLa, a fim de diminuir a proteína brca1 endógena, o que causa uma redução no número de células positivas de GFP. Ao mesmo tempo, uma proteína MUTANTe BRCA1 também foi transfeinada e produzida pela célula. Se a proteína mutada estava totalmente funcional, causou uma recuperação no número de células positivas de GFP, mas se a mutação afetou negativamente a função, então o número de células positivas de GFP permaneceu baixo.
Como alternativa aos métodos de transfecção química, um pesquisador, mostrado aqui, usa uma arma genética para disparar partículas de ouro atadas com DNA em células na cultura. Células que acabam com as pequenas balas revestidas de DNA dentro de seu citoplasma têm uma boa chance de se tornarem transfeccionadas.
Outro método alternativo para transfecção é a eletroporação. A eletroporação é o uso de corrente elétrica para danificar a membrana da célula permitindo que o DNA ou RNA entrem na célula por um curto período de tempo antes que as células tenham tempo para reparar. Aqui, eletrodos de pinça são colocados em torno de um cérebro de rato e pulsos curtos de eletricidade são passados através do cérebro para iniciar a transfecção ex-vivo das moléculas RNAi injetadas dentro da solução azul. Observa-se então os efeitos do silenciamento genético na estrutura do córtex em desenvolvimento.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre transfecção. Como sempre, obrigado por assistir!
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Disclosures
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