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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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제브라피시 미세 주입 기술

Overview

제브라피시(Daniorerio)와함께 작업하는 데 있어 주요 장점 중 하나는 초기 단계 배아의 미세 주입에 의해 유전학을 쉽게 조작할 수 있다는 것입니다. 이 기술을 사용하여, 유전 물질 또는 녹다운 구조를 포함하는 해결책은 blastomeres로 전달됩니다: 새로 수정된 계란의 노른자 꼭대기에 앉아 있는 배아 세포. 세포질로의 전달은 blastomere로 직접 주입을 통해 달성되거나 용액이 노른자로 주입 된 후 발생하는 자연적인 세포질 운동을 통해 달성됩니다. 성공적인 유전 조작은 일반적으로 발달의 유전 기계장치를 해명하기 위하여 배아 표현형의 정량화에 선행됩니다.

이 비디오는 제브라피시 배아에서 미세 주입을 수행하는 소개를 제공합니다. 토론은 공기의 압력 펄스로 유체 운동을 통제하는 주입 장치 및 마이크로 인젝터를 포함하여 기술에 대한 필수 도구의 검토로 시작됩니다. 다음으로, 미세 주입 장치의 주입 및 교정 중에 배아를 안정화시키기 위해 천판의 붓기와 같은 중요한 준비 단계가 입증된다. 주사 절차는 주사를 수행해야 하는 시기와 장소에 대한 팁과 함께 제공됩니다. 마지막으로, 암RNA 주입을 통한 유전자 과발현, 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 전달에 의한 유전자 침묵, 특별히 설계된 플라스미드 DNA를 이용한 형질전환 제브라피시 생성 을 포함하는 미세 주입 기술의 적용이 논의된다.

Procedure

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제브라피시 배아의 미세 주입을 통해 연구자들은 유전자 기능 및 발달 역학을 연구하기 위해 개발 중인 동물에 직접 솔루션을 제공할 수 있습니다. 1에서 4 세포 단계에서 배아는 주사를 위해 자주 사용됩니다. 이 초기 단계에서 세포와 노른자를 분리하는 멤브레인이 없기 때문에 한 세포 또는 노른자에 주입 된 솔루션은 유기체 전체에 고르게 퍼집니다. 미세 주입을 사용하여, 단백질 생산 유전자는 주입된 물질의 종류에 따라 발현되거나 끌 수 있다. 이 비디오는 파이펫 준비, 배아 수집, 미세 주입 절차를 시연하고이 기술이 오늘날 실험실에서 사용되는 몇 가지 방법에 대해 논의합니다.

먼저, 미세 주입 시스템의 주요 구성 요소인 스테레오스코프, 마이크로인젝터, 파이펫 홀더 및 마이크로 조작기의 주요 구성 요소를 다루겠습니다.

마이크로인젝터는 사용자가 조정할 수 있는 공기의 압력 펄스를 통해 정확한 볼륨을 제공합니다. 파이펫 홀더는 프로시저 중에 사용하기 위해 파이펫을 고정하고 인젝터의 항공사에 연결합니다. 일반적으로 파이펫 홀더는 마이크로 조작기에 배치됩니다. 이 계측기를 사용하면 연구원이 주입 절차 중에 피펫 위치를 작고 정확하게 조정할 수 있습니다. 발 페달은 인젝터에 연결되어 있으며 연구원이 주사 물질 전달을위한 압력 펄스를 동시에 활성화하면서 손의 사용을 유지할 수 있습니다. 마지막으로, 입체 스코프는 연구원이 배아를 보고 미세 주입 절차 도중 파이펫의 위치에 집중할 수 있게 합니다.

미세 주입이 시작되기 전에 유리 바늘을 준비해야합니다. 미세 주입 바늘은 사출 물질의 정확한 전달을 허용하기 위해 일관된 크기여야합니다. 파이펫 풀러는 매번 미세하고 날카로운 파이펫을 준비시키는 데 도움이 됩니다. 풀러는 유리 모세관 튜브를 가열하면서 튜브에 당기는 힘을 발휘하여 두 개의 파이펫 바늘을 생성합니다.

현미경의 밑에, 집게를 사용하여, 끝은 액체의 일관된 부피를 전달하는 것을 허용하는 방식으로 끊어지지만, 제브라피시 배아를 관통하기 위한 바늘의 선명도를 유지합니다.

페놀 레드, 주사 절차를 시각화 하는 데 도움이 되는 데 사용 되는 염료, 배아내 성공적인 주입을 추적 하기 위해 주사 솔루션과 혼합 될 수 있다.

바늘은 모세관 작용을 통해 팁 측에서 사출 용액으로 로드할 수 있으며 마이크로 로더 주사기로 백필 할 수 있습니다. 주사를 위해 바늘을 로드하면 마이크로 조작기의 파이펫 홀더에 삽입 할 수 있습니다.

주사 바늘이 준비된 후에, 마이크로인젝터 압력 및 시간 설정은 각 바늘을 보정하기 위하여 조정됩니다, 일관된 양이 각 태아에게 전달되는 것을 보장할 것입니다. 스테레오스코프 하에서 소량의 용액이 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울에 주입됩니다. 액적의 크기를 측정하고 바늘이 분산되는 부피를 계산할 수 있다. 이어서, 마이크로인젝터의 압력을 더 조절할 수 있으며, 원하는 크기의 액적이 정기적으로 얻어질 때까지 공정이 반복된다.

바늘이 준비되고 보정되면 배아는 주사를 위해 얻어지고 배치됩니다.

배아는 미세 주입 챔버에 의해 주입 하는 동안 신중 하 게 배치 하 고 고정 개최 해야 합니다. 미세 주입 챔버를 만들기 위해, 곰팡이는 페트리 접시에 배치하고 용융 아가로즈는 접시에 부어 경화 할 수 있습니다. 일단 고화되면, 곰팡이가 제거되고 배아 배지가 위에 부어오른다. 배아는 이송 파이펫을 사용하여 금형에 의해 생성된 쓰루에 줄 지어 수 있습니다. 아가로즈에서 배아를 배열하는 한 가지 대안은 현미경 슬라이드의 가장자리를 따라 줄을 서미세 주입을위한 컬럼에 배치됩니다.

일단 그(것)들이 위치에 있으면, 태아는 주입될 준비가 됩니다.

배아는 노른자 또는 세포질로 주입될 수 있다. 노른자에 주입하는 것은 간단하고 덜 정교한 주입 기술이 필요하며 세포질에 주입하는 것이 더 어렵지만 더 강력한 결과를 얻을 수 있습니다. 노른자에 주입하려면 마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 움직여 초리온과 노른자를 관통합니다. 발 페달은 바늘의 내용이 노른자로 추방될 수 있도록 도청됩니다. 세포질 유동 및 확산을 통해 사출 용액이 세포로 흘러 들어갈 수 있습니다.

세포질에 주입하는 것은 세포질이 효과적으로 표적으로 할 수 있도록 태아의 주의 깊은 위치 지정을 요구합니다.

주사 후, 배아는 새로운 접시로 옮겨지고 28.5°C에서 배양된다. 그(것)들은 죽은 태아를 제거하기 위하여 수시로 검사됩니다.

주사의 성공을 결정하기 위해, 배아는 그들의 전반적인 외관, 형광 마커의 존재, 그리고 지노티핑을 사용하여 그들의 게놈에 있는 변경을 찾아서 분석될 수 있습니다.

이제 제브라피시 배아를 주입하는 방법을 이해하게 되었으므로 과학자들이 이 기술을 사용하여 유전자의 기능을 이해하는 방법을 살펴보겠습니다.

첫째, 과학자들은 합성 된 mRNA를 주입하여 특정 유전자를 과발현하고 표현형을 관찰하여 기능을 결정할 수 있습니다. 이 같은 기술은 또한 발달 도중 생기는 사이토스켈레탈 재배열과 같은 분자 사건을 강조하는 단백질을 표현하는 것을 이용될 수 있습니다.

둘째, 유전자는 모르폴리노의 주입에 의해 꺼질 수 있다. Morpholinos는 표준 핵산 염기 페어링에 의해 특정 mRNA 서열에 결합하도록 설계될 수 있는 안정적인 합성 핵산 유사체이며, 변환을 차단한다. 차례로, 이것은 그 mRNA에 의해 생성된 단백질의 손실로 이끌어 냅니다. 이 효력은 연구원이 그것의 부재에서 개발이 어떻게 변경되는지 보고해서 발달에 있는 특정 유전자의 역할을 이해하는 것을 허용합니다.

주사는 제브라피시에 외국 DNA를 통합하는 데 사용할 수 있습니다. DNA 수정 효소에 대한 인식 부위를 포함하는 서열을 주입함으로써 과학자들은 수정된 게놈으로 "형질 전환" 물고기를 효율적으로 생성할 수 있으며, 이는 외국 유전자가 미래 세대에게 전달될 것임을 의미합니다. 서열 설계에 따라, 유전자 발현은 특정 조직 또는 특정 발달 시점에 국한될 수 있다.

당신은 단지 초기 제브라피시 배아의 미세 주입에 JoVE의 소개를 보았다. 이 비디오는 미세 주입 설정을 도입하고, 미세 주입 바늘을 준비하는 방법을 시연하고, 미세 주입을 위해 배아를 준비하는 방법을 보여 주며, 미세 주입 기술을 수행하고, 미세 주입의 일부 응용 프로그램을 수행합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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