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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Técnicas de microinyección en el pez cebra

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Zebrafish Microinjection Techniques

4.13: Introducing Experimental Agents into the Mouse

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08:12 min

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April 30, 2023

Overview

Una de las principales ventajas de trabajar con el pez cebra (Danio rerio) es que su genética puede ser fácilmente manipulado por microinyección de embriones de etapa temprana. Usando esta técnica, soluciones que contengan construcciones de precipitación o material genéticas se entregan en los blastómeros: las células embrionarias sentado encima de la yema del huevo recién fecundado. Entrega en el citoplasma se realiza mediante inyección directa en el blastómero, o a través de movimientos citoplásmicos naturales que se producen después de que una solución se inyecta en la yema de huevo. Cuantificación de fenotipos embrionarias siguen generalmente exitosa manipulación genética para dilucidar los mecanismos genéticos del desarrollo.

Este video le proporcionará una introducción a la realización de microinyecciones en embriones de pez cebra. La discusión comienza con una revisión de las herramientas esenciales para la técnica, incluyendo el aparato de inyección y el microinyector, que controla el movimiento de fluidos con pulsos de presión de aire. Siguientes, importantes pasos preparatorios se han demostrado como el verter de las placas de agar para estabilizar los embriones durante la inyección y calibración de los aparatos de microinyección. Luego se presenta el procedimiento de inyección junto con consejos sobre dónde y cuándo se deben realizar las inyecciones. Finalmente, se discuten las aplicaciones de la técnica de microinyección, incluyendo sobreexpresión de genes vía inyección de mRNA, por entrega de oligonucleótidos antisentido morfolino y la generación de pez cebra transgénico utilizando especialmente el silenciamiento del gen diseñado el DNA plasmídico.

Procedure

Microinyección de embriones de pez cebra permite a los investigadores a soluciones directamente en el desarrollo animal, con el fin de estudiar la función genética y dinámica de desarrollo. Se utilizan con frecuencia los embriones desde la fase de 1 a 4 células de inyección. Porque hay membranas de separación de las células y la yema de huevo en esta primera etapa, soluciones que se inyecta en una célula o en la yema se extenderán uniformemente en todo el organismo. Mediante la microinyección, genes de producción de proteína pueden ser expresados o apagados, dependiendo del tipo de material inyectado. Este video se demuestran preparación de pipeta, colección embrionaria, el procedimiento de microinyección y discutir algunas de las formas de que esta técnica se utiliza en los laboratorios de hoy.

Primero, vamos a cubrir los principales componentes del sistema de microinyección: el estereoscopio, microinyector, soporte de pipeta y amalgamas dentales.

La microinyectora ofrece volumen preciso a través de pulsos de presión de aire, que puede ser ajustado por el usuario. El titular de la pipeta asegura la pipeta para su uso durante el procedimiento y lo conecta a la línea aérea del inyector. Por lo general, el titular de la pipeta se coloca en un micromanipulador. Este instrumento permite al investigador hacer pequeños y precisos ajustes en la ubicación de la pipeta durante el procedimiento de inyección. Un pedal está conectado al inyector y permite al investigador mantener el uso de sus manos mientras que al mismo tiempo activar el pulso de presión para la entrega de material de inyección. Finalmente, el estereoscopio permite al investigador ver los embriones y se centran en la localización de la pipeta durante el procedimiento de microinyección.

Antes de empezar microinyección, agujas de cristal deben ser preparadas. Agujas de microinyección deben ser de un tamaño constante para permitir la entrega precisa de material de inyección. Un extractor de pipeta ayuda a asegurar bien y sharp pipetas se preparan cada vez. El tirador calienta un tubo capilar de vidrio y ejerciendo fuerza que tira en el tubo, dando por resultado dos agujas de la pipeta.

Bajo el microscopio, con unas pinzas, la punta se corta de manera que permite un volumen constante de líquido para ser entregado, mantiene todavía la agudeza de la aguja para perforar el embrión de pez cebra.

Rojo de fenol, un colorante utilizado para ayudar a visualizar el procedimiento de la inyección, se puede mezclar con la solución de la inyección para detectar inyección acertada en el embrión.

Las agujas pueden cargarse con la solución de la inyección desde el lado de punta vía acción capilar, o pueden ser rellenados con una jeringa microloader. Una vez que se carga la aguja para la inyección, puede ser insertado en el soporte de pipetas en el micromanipulador.

Después de que las agujas de inyección estén listas, se ajustan los ajustes de presión y tiempo de microinyectora para calibrar cada aguja, que garanticen que un volumen constante se entrega a cada embrión. Bajo el estereoscopio, se inyecta una pequeña cantidad de solución en una gota de aceite mineral en una diapositiva. El tamaño de la gota se mide y se puede calcular el volumen que la aguja se dispersa. Posteriormente, la presión de la microinyectora puede ajustarse más y repite el proceso hasta que una gota del tamaño deseado se obtiene regularmente.

Una vez que las agujas están preparadas y calibradas, embriones obtenidos y arreglados para la inyección.

Embriones deben ser colocados cuidadosamente y sostenidos inmóviles durante la inyección por una cámara de microinyección. Para crear una cámara de microinyección, moldes se colocan en una placa Petri y agarosa fundida se vierte en el plato y se deja endurecer. Una vez que ha solidificado, se retira el molde y se vierte el medio de embrión en la parte superior. Los embriones pueden ser alineados en canales que fueron creadas por el molde utilizando una pipeta de transferencia. Una alternativa a los embriones en agarosa de arreglar es a les en el borde de un portaobjetos de microscopio, por lo que se colocan en una columna para microinyección

Una vez en posición, los embriones están listos para ser inyectados.

Embriones se pueden inyectar en la yema de huevo o de la célula citoplasma. Inyección en la yema de huevo es más sencilla y requiere menos sofisticada técnica de inyección, mientras que la inyección en el citoplasma es más difícil, pero produce resultados más robustos. Para inyectar en la yema de huevo, utilizar el instrumental quirúrgico para mover la aguja que perfora el corión y luego la yema. El pedal es luego aprovechado para provocar el contenido de la aguja para ser expulsados en yema de huevo. Difusión y flujo citoplásmico permite la solución de la inyección fluir en la célula.

Inyección en el citoplasma requiere cuidadosa colocación del embrión, por lo que el citoplasma puede orientarse eficazmente.

Después de la inyección, embriones son transferidos a una nueva placa y se incubó a 28,5 ° C. Con frecuencia se comprueban para eliminar embriones muertos.

Para determinar el éxito de la inyección, los embriones pueden analizarse basado en su aspecto general, la presencia de un marcador fluorescente y buscando cambios en su genoma mediante genotipificación.

Ahora que entiendes cómo inyectar embriones de pez cebra, veamos cómo los científicos pueden utilizar esta técnica para entender la función de los genes.

En primer lugar, los científicos pueden inyectar mRNA sintetizado para sobreexpresar ciertos genes y determinar su función, observando el fenotipo. Esta misma técnica puede utilizarse también para expresar proteínas que destacan acontecimientos moleculares, tales como los cambios citoesqueléticos que ocurren durante el desarrollo.

En segundo lugar, los genes se pueden apagar por la inyección de morfolinos. Morfolinos son análogos estables de ácido nucleico sintético que pueden ser diseñados para atar a las secuencias de mRNA específicos por ácido nucleico estándar base que se aparea y bloquean la traducción. A su vez, esto conduce a la pérdida de la proteína producida por eso mRNA. Este efecto permite a los investigadores a entender el papel de un gen particular en desarrollo al ver cómo el desarrollo se altera en su ausencia.

La inyección puede utilizarse para incorporar ADN extraño en el pez cebra. Mediante la inyección de secuencias que contienen sitios de reconocimiento para enzimas modificadoras de la DNA, los científicos pueden generar eficientemente peces “transgénicos” con genomas modificados, significa que genes extranjeros pasará a las generaciones futuras. Dependiendo del diseño de la secuencia, expresión génica puede limitarse a tejidos específicos o los puntos específicos de tiempo del desarrollo.

Sólo ha visto introducción de Zeus a la microinyección de embriones de pez cebra temprano. Este video ha introducido la configuración de la microinyección, demostró cómo preparar agujas de microinyección, se muestra cómo preparar embriones para microinyección, realizar la técnica de microinyección y algunas aplicaciones de microinyección. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Microinjection of zebrafish embryos allows researchers to deliver solutions directly into the developing animal, in order to study gene function and developmental dynamics. Embryos from the 1 to 4-cell stage are frequently used for injection. Because there are no membranes separating the cells and the yolk at this early stage, solutions injected in either one cell or the yolk will evenly spread throughout the organism. By using microinjection, protein production genes can be expressed, or turned off, depending on the type of material injected. This video will demonstrate pipette preparation, embryo collection, the microinjection procedure, and discuss some of the ways this technique is used in labs today.

First, let’s cover the major components of the microinjection system: The stereoscope, microinjector, pipette holder, and micromanipulator.

The microinjector delivers precise volume through pressure pulses of air, which can be adjusted by the user. The pipette holder secures the pipette for use during the procedure and connects it to the airline of the injector. Typically, the pipette holder is placed in a micromanipulator. This instrument allows the researcher to make small and accurate adjustments to the pipette location during the injection procedure. A foot pedal is connected to the injector and allows the researcher to maintain use of their hands while simultaneously activating the pressure pulse for injection material delivery. Finally, the stereoscope allows the researcher to see the embryos and focus on the location of the pipette during the microinjection procedure.

Before microinjection can begin, glass needles must be prepared. Microinjection needles must be of a consistent size to allow for precise delivery of injection materials. A pipette puller helps ensure fine and sharp pipettes are prepared every time. The puller heats a glass capillary tube while exerting force that pulls on the tube, resulting in two pipette needles.

Under the microscope, using forceps, the tip is cut off in a manner that allows for a consistent volume of liquid to be delivered, yet maintains the sharpness of the needle for piercing the zebrafish embryo.

Phenol red, a dye used to help visualize the injection procedure, can be mixed with the injection solution in order to track successful injection into the embryo.

Needles can be loaded with injection solution from the tip side via capillary action, or they can be backfilled with a microloader syringe. Once the needle is loaded for injection, it can be inserted into the pipette holder on the micromanipulator.

After the injection needles are ready, the microinjector pressure and time settings are adjusted in order to calibrate each needle, which will ensure a consistent volume is delivered to each embryo. Under the stereoscope, a small amount of solution is injected into a drop of mineral oil on a slide. The size of the droplet is measured and the volume that the needle disperses can be calculated. Subsequently, the pressure of the microinjector can be further adjusted and the process repeated until a droplet of the desired size is regularly obtained.

Once needles are prepared and calibrated, embryos are obtained and arranged for injection.

Embryos must be positioned carefully and held stationary during injection by a microinjection chamber. To create a microinjection chamber, molds are placed in a petri dish and molten agarose is poured into the dish and allowed to harden. Once it has solidified, the mold is removed and the embryo medium is poured on top. The embryos can be lined up in troughs that were created by the mold using a transfer pipette. One alternative to arranging the embryos in agarose is to line them up along the edge of a microscope slide, so they are positioned in a column for microinjection

Once they are in position, the embryos are ready to be injected.

Embryos can be injected either into the yolk or cell cytoplasm. Injection into the yolk is simpler and requires less sophisticated injection technique, while injection into the cytoplasm is more difficult, but yields more robust results. To inject into the yolk, use the micromanipulator to move the needle so that it pierces the chorion and then the yolk. The foot pedal is then tapped to cause the contents of the needle to be expelled into yolk. Cytoplasmic flow and diffusion allows the injection solution to flow into the cell.

Injection into the cytoplasm requires careful positioning of the embryo, so that the cytoplasm can be effectively targeted.

Following injection, embryos are transferred to a new dish and incubated at 28.5 °C. They are frequently checked to remove dead embryos.

To determine the success of the injection, embryos can be analyzed based on their overall appearance, the presence of a fluorescent marker, and by looking for changes in their genome using genotyping.

Now that you understand how to inject zebrafish embryos, let’s look how scientists can use this technique to understand the function of genes.

First, scientists can inject synthesized mRNA to overexpress certain genes and determine their function by observing phenotype. This same technique can also be used to express proteins that highlight molecular events, such as the cytoskeletal rearrangements that occur during development.

Second, genes can be turned off by the injection of morpholinos. Morpholinos are stable synthetic nucleic acid analogs that can be designed to bind to specific mRNA sequences by standard nucleic acid base pairing, and block translation. In turn, this leads to loss of the protein produced by that mRNA. This effect allows researchers to understand the role of a particular gene in development by seeing how development is altered in its absence.

Injection can be used to incorporate foreign DNA into the zebrafish. By injecting sequences containing recognition sites for DNA modifying enzymes, scientists can efficiently generate “transgenic” fish with modified genomes, meaning that foreign genes will be passed on to future generations. Depending on the sequence design, gene expression can be confined to specific tissues or specific developmental timepoints.

You’ve just watched JoVE’s introduction to microinjection of early zebrafish embryos. This video has introduced the microinjection setup, demonstrated how to prepare microinjection needles, shown how to prepare embryos for microinjection, perform the microinjection technique, and some applications of microinjection. As always, thanks for watching!

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