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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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Técnicas de Microinjeção de Zebrafish

Overview

Uma das principais vantagens de trabalhar com zebrafish (Danio rerio) é que sua genética pode ser facilmente manipulada pela microinjeção de embriões em estágio inicial. Usando esta técnica, soluções contendo material genético ou construtos de knockdown são entregues nos blastomeres: as células embrionárias sentadas no topo da gema do óvulo recém-fertilizado. A entrega no citoplasma é obtida através da injeção direta no blastomere, ou através de movimentos citoplasmáticos naturais que ocorrem após uma solução ser injetada na gema. Manipulações genéticas bem sucedidas são geralmente seguidas pela quantificação de fenótipos embrionários a fim de elucidar os mecanismos genéticos de desenvolvimento.

Este vídeo fornecerá uma introdução à realização de microinjeções em embriões de zebrafish. A discussão começa com uma revisão das ferramentas essenciais para a técnica, incluindo o aparelho de injeção e o microinjetor, que controla o movimento do fluido com pulsos de pressão do ar. Em seguida, são demonstrados importantes passos preparatórios, como o derramamento de placas de ágar para estabilizar embriões durante a injeção e calibração do aparelho de microinjeção. O procedimento de injeção é então apresentado juntamente com dicas sobre quando e onde as injeções devem ser realizadas. Finalmente, são discutidas aplicações da técnica de microinjeção, incluindo superexpressão genética via injeção de mRNA, silenciamento genético por meio da entrega de oligonucleotídeos de morfolino antiscenos e a geração de zebrafish transgênicos usando DNA plasmídeo especialmente projetado.

Procedure

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A microinjeção de embriões de zebrafish permite que os pesquisadores entreguem soluções diretamente no animal em desenvolvimento, a fim de estudar a função genética e a dinâmica do desenvolvimento. Embriões do estágio de 1 a 4 células são frequentemente usados para injeção. Como não há membranas que separem as células e a gema neste estágio inicial, as soluções injetadas em uma célula ou na gema se espalharão uniformemente pelo organismo. Usando microinjeção, genes de produção de proteínas podem ser expressos ou desligados, dependendo do tipo de material injetado. Este vídeo demonstrará a preparação da pipeta, a coleta de embriões, o procedimento de microinjeção e discutirá algumas das maneiras como essa técnica é usada em laboratórios hoje.

Primeiro, vamos cobrir os principais componentes do sistema de microinjeção: estereóscópio, microinjetor, porta-pipetas e micromanipulador.

O microinjetor fornece volume preciso através de pulsos de pressão de ar, que podem ser ajustados pelo usuário. O porta-pipetas prende a pipeta para uso durante o procedimento e a conecta à companhia aérea do injetor. Normalmente, o porta-pipetas é colocado em um micromanipulador. Este instrumento permite que o pesquisador faça pequenos e precisos ajustes no local da pipeta durante o procedimento de injeção. Um pedal de pé é conectado ao injetor e permite que o pesquisador mantenha o uso de suas mãos enquanto ativa simultaneamente o pulso de pressão para entrega de material de injeção. Finalmente, o estereoscópio permite ao pesquisador ver os embriões e focar na localização da pipeta durante o procedimento de microinjeção.

Antes que a microinjeção possa começar, agulhas de vidro devem ser preparadas. As agulhas de microinjeção devem ser de tamanho consistente para permitir a entrega precisa de materiais de injeção. Um puxador de pipeta ajuda a garantir que as pipetas finas e afiadas sejam preparadas sempre. O puxador aquece um tubo capilar de vidro enquanto exerce força que puxa o tubo, resultando em duas agulhas de pipeta.

Sob o microscópio, usando fórceps, a ponta é cortada de uma maneira que permite que um volume consistente de líquido seja entregue, mas mantém a nitidez da agulha para perfurar o embrião de zebrafish.

O vermelho fenol, um corante usado para ajudar a visualizar o procedimento de injeção, pode ser misturado com a solução de injeção, a fim de rastrear a injeção bem sucedida no embrião.

As agulhas podem ser carregadas com solução de injeção do lado da ponta através de ação capilar, ou podem ser reabastecidos com uma seringa de microcarregador. Uma vez que a agulha é carregada para injeção, ela pode ser inserida no suporte de pipeta no micromanipulador.

Depois que as agulhas de injeção estiverem prontas, as configurações de pressão e tempo do microinjetor são ajustadas para calibrar cada agulha, o que garantirá que um volume consistente seja entregue a cada embrião. Sob o estereoscópio, uma pequena quantidade de solução é injetada em uma gota de óleo mineral em um slide. O tamanho da gotícula é medido e o volume que a agulha dispersa pode ser calculado. Posteriormente, a pressão do microinjetor pode ser ainda mais ajustada e o processo repetido até que uma gota do tamanho desejado seja regularmente obtida.

Uma vez que as agulhas são preparadas e calibradas, os embriões são obtidos e arranjados para injeção.

Os embriões devem ser posicionados cuidadosamente e mantidos estacionários durante a injeção por uma câmara de microinjeção. Para criar uma câmara de microinjeção, moldes são colocados em uma placa de petri e agarose derretida é derramado na placa e permitido endurecer. Uma vez solidificado, o molde é removido e o meio do embrião é derramado em cima. Os embriões podem ser alinhados em cochos que foram criados pelo molde usando uma pipeta de transferência. Uma alternativa para organizar os embriões em agarose é alinhá-los ao longo da borda de um slide de microscópio, para que eles estejam posicionados em uma coluna para microinjeção

Uma vez em posição, os embriões estão prontos para serem injetados.

Embriões podem ser injetados na gema ou citoplasma celular. A injeção na gema é mais simples e requer técnica de injeção menos sofisticada, enquanto a injeção no citoplasma é mais difícil, mas produz resultados mais robustos. Para injetar na gema, use o micromanipulador para mover a agulha para que ela fure o acorde e, em seguida, a gema. O pedal do pé é então tocado para fazer com que o conteúdo da agulha seja expelido em gema. O fluxo citoplasmático e a difusão permitem que a solução de injeção flua para dentro da célula.

A injeção no citoplasma requer um posicionamento cuidadoso do embrião, para que o citoplasma possa ser efetivamente direcionado.

Após a injeção, os embriões são transferidos para um novo prato e incubados a 28,5 °C. Eles são frequentemente verificados para remover embriões mortos.

Para determinar o sucesso da injeção, os embriões podem ser analisados com base em sua aparência geral, na presença de um marcador fluorescente e procurando mudanças em seu genoma usando genotipagem.

Agora que você entende como injetar embriões de zebrafish, vamos ver como os cientistas podem usar essa técnica para entender a função dos genes.

Primeiro, os cientistas podem injetar mRNA sintetizado para superexpressar certos genes e determinar sua função observando o fenótipo. Essa mesma técnica também pode ser usada para expressar proteínas que destacam eventos moleculares, como os rearranjos citoesqueléticos que ocorrem durante o desenvolvimento.

Segundo, genes podem ser desligados pela injeção de morfolnos. Morpholinos são análogos de ácido nucleico sintético estáveis que podem ser projetados para se ligar a sequências específicas de mRNA por emparelhamento padrão da base de ácido nucleico e tradução de blocos. Por sua vez, isso leva à perda da proteína produzida por esse mRNA. Esse efeito permite que os pesquisadores entendam o papel de um determinado gene no desenvolvimento, vendo como o desenvolvimento é alterado em sua ausência.

A injeção pode ser usada para incorporar DNA estranho no zebrafish. Ao injetar sequências contendo locais de reconhecimento para enzimas modificadoras de DNA, os cientistas podem gerar eficientemente peixes "transgênicos" com genomas modificados, o que significa que genes estrangeiros serão passados para as gerações futuras. Dependendo do desenho da sequência, a expressão genética pode ser limitada a tecidos específicos ou pontos de tempo específicos de desenvolvimento.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à microinjeção de embriões de zebrafish. Este vídeo introduziu a configuração de microinjeção, demonstrou como preparar agulhas de microinjeção, mostrou como preparar embriões para microinjeção, realizar a técnica de microinjeção e algumas aplicações de microinjeção. Como sempre, obrigado por assistir!

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