인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

이 절차의 전반적인 목표는 짧고 재현 가능하며 정의된 프로토콜로 인간 만능 줄기 세포에서 신경능선 전구 세포를 생성하는 것입니다. 그런 다음 이러한 세포는 in vitro에서 신경능선 관련 질병을 연구하거나 이러한 세포를 자손 세포로 지속적으로 분화하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 먼저 matrigel의 단층에 고밀도의 인간 만능 줄기 세포를 도금함으로써 이루어집니다.

두 번째 단계는 주요 신호 경로에 영향을 미치는 작은 분자의 정의된 서열과 조합을 사용하여 세포를 신경 상피 세포로 분화하는 것입니다. 다음으로, 신경 상피 세포는 재도금되고 더 나아가 신경능선 전구 세포로 분화됩니다. 마지막 단계는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 신경능선 세포를 분리하는 것입니다.

궁극적으로 면역형광과 세포의 이동 능력과 같은 기능적 분석을 사용하여 적절한 신경능선세포가 생성되었음을 보여줍니다. 인간 만능 줄기 세포에서 신경 능선 세포를 유도하기 위한 기존 프로토콜에 비해 이 기술의 주요 장점은 더 짧다는 것입니다. 18일밖에 남지 않았습니다.

MS five feeder cell이 없기 때문에 재현성이 더 높습니다. 확대하기 쉬우며 인간 만능 줄기 세포주에서 재현성이 높습니다. 이 기술의 의미는 신경 계통과 관련된 인간 질병의 메커니즘 연구로 확장되며 이러한 질병의 세부 체외 모델링 및 약물 스크리닝을 개선할 수 있는 잠재력을 보여줍니다.

시작하기 전에 이 프로토콜은 인간 만능 줄기 세포의 군집이 눈으로 볼 수 있을 만큼 충분히 크고, 여전히 경계에 분화 세포가 거의 없는 날카로운 모서리를 가지고 있는지 확인했습니다. 그런 다음 H PSC를 분할할 준비가 되면 1개의 XPBS로 5밀리리터로 매체 세척을 한 번 흡인하고 EDTA에서 0.05% 트립 4밀리리터를 세포에 다음으로 격렬하게 추가합니다. 현미경으로 쥐의 배아 섬유아세포가 플레이트에서 단세포로 들어 올려질 때까지 접시를 수평으로 2분 동안 흔듭니다.

HPSC 콜로니는 콜로니로 접시에 부착된 상태로 유지된 다음 즉시 트립신을 완전히 흡인하고 플레이트를 실온에서 2-4분 동안 그대로 둡니다. 2ml의 HES 배지를 플레이트에 추가하고 P 1000 피펫을 사용하여 셀을 분리합니다. 세포가 쉽게 들어올려지지 않으면 플레이트를 추가로 2-3분 동안 배양합니다.

실온에서 세포 현탁액을 10 마이크로몰 Y 2 7 6 3 2 디하이드로클로라이드가 보충된 8 밀리리터의 HES 배지가 포함된 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 이전에 처리된 10cm 접시에서 마트리겔을 흡인하고 마트리겔 처리된 플레이트에 1:1 또는 1:2 비율로 세포를 플레이트합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.

세포가 분화 준비가 될 때까지 매일 HES 배지를 공급합니다. 그런 다음 세포가 90%에서 100% 융합될 때 신경 분화를 시작합니다. 오늘은 제로데이입니다.

0일차부터 3일차까지 매일 10ml의 KSR 분화, 0.1 마이크로몰, LDN 1, 9, 3, 8, 9 및 10 MICROMOLAR SB 4 3 1 5 42를 포함하는 배지를 세포에 공급합니다. 그런 다음 4일차와 5일차에 75% KSR 분화, 중간 25% 및 2, 분화 배지 0.1, 마이크로몰 LDN 1, 9 3, 1, 8, 9 및 10 마이크로몰 SB 4 3 1 5 42를 포함하는 배지 10ml를 세포에 공급합니다. 6일과 7일째에 0.1 마이크로몰 LDN, 1, 9 3, 1, 8, 9 및 10 마이크로몰 SB 4 3 1 5 2를 보충하는 것 외에도 50% KSR 분화, 중간 및 50% 분화 배지를 포함하도록 조정된 배지를 세포에 공급합니다.

8일째에서 9일째 동안 0.1 마이크로몰 LDN 1 9 3 1 8, 9 및 10 마이크로몰 SB 4 3 5 2를 포함하는 25% KSR 분화 배지 및 75% 분화 배지를 세포에 공급합니다. 그런 다음 9일과 10일째에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 poly L orhan laminin one 및 fibronectin으로 배양 접시를 준비하고, 11일에 세포를 재도금하는 데 사용되며, 0.1 micromolar L DN 1 9 3, 109 및 10 micromolar SB 4 31 5 42가 보충된 N 두 개의 분화 배지를 세포에 공급합니다. 10일째 11일째에 미리 준비한 배양 접시에서 라미닌 원과 피브로넥틴 용액을 흡인하고 조직 배양 후드에서 실온에서 20-30분 동안 건조시킵니다.

다음으로, 분화 세포에서 배지를 제거하고 하나의 XPBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 각 10cm 플레이트에 8ml의 acuate를 추가하고 섭씨 37도에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 세포 리프터를 사용하여 세포를 분리한 다음 Accutane 용액에서 세포를 재현탁합니다.

5ml 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 튜브에 1 XPBS의 5 밀리리터를 추가하고 115 Gs.Disburtanant에서 5 분 동안 세포를 회전시키고 1 XPBS의 10 밀리리터에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 그런 다음 40미크론 세포 트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하여 단일 세포 현탁액을 보장합니다.

혈류 세포 분석기를 사용하여 세포를 계수합니다. 115Gs에서 5분 동안 세포를 다시 스핀다운하고 세포를 보충된 N 2 분화 배지의 10마이크로리터당 100, 000 - 150, 000 세포의 농도로 재현탁합니다. 리피터 피펫을 사용하여 poly L orhan으로 전처리된 15cm 배양 접시에 세포 현탁액의 10마이크로리터 방울을 플레이트합니다.

라미닌 1과 피브로넥틴. 물방울을 실온에서 15-20분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 매우 조심스럽게 30 밀리리터의 보충 된 N에서 두 개의 분화 매체를 액적을 방해하지 않고 플레이트에 넣습니다.

섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. 12일째에 200마이크로몰을 soic acid로 포함하는 20ml의 N 2 분화 배지를 세포에 조심스럽게 공급합니다. 뇌 유래 신경 영양 인자 밀리리터당 20나노그램, 섬유아세포 성장 인자 8밀리리터당 100나노그램, 15cm 접시당 음파 고슴도치 밀리리터당 20나노그램.

그런 다음 14일에서 17일까지, 2-3일마다 200마이크로몰만 오릭산으로 함유된 N개의 분화 배지를 세포에 공급합니다.뇌 유래 신경 영양 인자의 밀리리터당 20나노그램과 섬유아세포 성장의 밀리리터당 100나노그램. 여덟 번째 요인, 16일과 17일에 폴리, L 또는 라미닌 1, 피브로넥틴이 함유된 플레이트를 준비하여 신경능선세포를 재생하는 데 사용합니다.

18일째 팩스 분석 후, 형광 활성화 세포 분류로 세포를 분류한 후 신경능선 세포를 계수한 다음 115G에서 5분 동안 스핀다운합니다. 셀 펠릿을 N 2에 다시 현탁시킵니다. 밀리리터당 10나노그램이 보충된 분화 배지.

FGF 2 밀리리터 EGF 및 10 마이크로 몰 Y 2 7 6 3 2 디 염산염 당 2 2 나노 그램 30, 10 마이크로 리터 당 000 세포. 철저하게 건조 배양 접시는 이전에 폴리 L orhan laminin one 및 fibronectin으로 준비되었습니다. 그런 다음 10cm 접시당 약 50-70개의 세포 현탁액 방울을 플레이트에 넣습니다.

세포를 실온에서 15-20분 동안 20밀리리터의 N2로 배양합니다. 밀리리터당 10나노그램이 보충된 분화 배지. FGF, 밀리리터당 20나노그램, EGF 2개, 10마이크로몰, Y, 2, 7, 6, 3, 2, 디하이드로클로라이드, 물방울을 방해하지 않고 각 10cm 접시에 넣습니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. 배양 후, 신경 능선 세포를 유지 및 배양하고, 동반된 텍스트 프로토콜에 따라 신경 능선 세포는 18일 만에 인간 만능 줄기 세포에서 유래되었습니다. 이 새로운 피더 프리 체외 분화 프로토콜 사용.

18일째 팩스 분석에서는 HNK 1과 P 75 모두에 대해 양성인 세포가 확인되었으며, 이를 통해 신경능선세포의 존재를 확인했습니다. feeder free differentiation protocol과 feeder cell dependent protocol 모두에서 신경능선세포는 neural roset 단계를 통과했습니다. 또한, 분류된 세포는 동일한 형태를 가지며 신경능선 마커를 발현했으며, H와 K 1 및 P 2를 이 두 분화 프로토콜에서 파생된 신경능선 세포의 전체 유전자 발현을 비교한 결과 두 세포 세트가 밀접하게 결합되어 있음을 발견했습니다.

feeder free 프로토콜을 사용하여 유도된 신경능선세포의 이동 능력을 분석한 결과, 세포가 48시간 후에 스크래치로 성공적으로 이동했습니다. 이 세포는 또한 자율신경계에서 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 이는 4일간의 분화 기간 후에 mash one 및 touch one에 대한 양성 염색으로 확인되었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 만능 줄기세포를 신경질화하는 방법과 in vitro에서 신경능선 전구 세포를 유도하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.