Manipulation und In-vitro- Ausbau der Xenopus laevis Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, mütterliche Proteine, die in Eizellen gespeichert sind, abzuschalten oder Proteine von Interesse zum Zeitpunkt der Befruchtung von Froscheiern zu überexprimieren. Dies wird erreicht, indem Antisense-Oligos oder mRNA in enzymatisch deregulierte unreife Eizellen injiziert werden, um ein bestimmtes Protein abzubauen oder zu überexprimieren. In einem zweiten Schritt werden die Eizellen auf ein progesteronhaltiges Medium übertragen, das die Reifung der Eizellen zu den Eizellen induziert.

Anschließend werden Spermien in die in vitro gereiften Eizellen injiziert, um die Auswirkungen von Knockdown oder Überexpression auf die Embryonalentwicklung zu beobachten. Letztendlich ist die Entwicklung von Oligo-injizierten Eizellen für schwimmende Kaulquappen der Funktionstest für den Gen-Knockdown oder die Überexpression. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Gefäßen wie Wirt-zu-Transfer besteht darin, dass wir den Prozess der Froschoperation mit Standardprotokollen überspringen können.

Sammeln Sie ein Opus über SAC mit gesunden Zyten in einer neun Zentimeter großen Petroschale, die MBS plus ps enthält. Dann toupieren Sie den Eierstock in quadratische Stücke, die ein bis zwei Zentimeter breit sind. Sammeln Sie etwa fünf Milliliter des gerissenen Eierstocks mit Zyten in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie dann die Tücher einige Male mit MBS plus PS aus und sammeln Sie die Eier in 15 Millilitern frischem MBS plus PS. Geben Sie nun sieben Einheiten Entlaubungsenzym in die Suspension und inkubieren Sie die Suspension mit sanfter Vegetation, bis sie zumindest teilweise entlaubt sind. Dies wird mindestens eine Stunde nach der Inkubation dauern.

Füllen Sie das Röhrchen mit MBS plus Ps, um die Reaktion zu stoppen. Ziehen Sie die Lösung an die Wand des Röhrchens und nicht direkt an die Zyten. Lassen Sie das Taschentuch sich absetzen und entsorgen Sie die Suppe und das Mittel.

Kleine, unreife Zyten schwimmen und sollten ebenfalls verworfen werden. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt 10 Mal nach den Wäschen. Übertragen Sie die Zyten mit MBS plus ps in eine Neun-Zentimeter-Schale.

Übertragen Sie die Schale in ein Präpariermikroskop und halten Sie von hier aus die Zyten so weit wie möglich auf 16 bis 18 Grad Celsius. Wählen Sie hochwertige Zyten des sechsten Stadiums unter Verwendung der Dumont-Klassifizierung mit einer Glaspipette aus und sammeln Sie sie in einer neuen Schale mit MBS plus ps. Zyt von guter Qualität sollte eine gleichmäßige Pigmentierung in der tierischen Hemisphäre aufweisen und eine klare Trennung zwischen der tierischen und der pflanzlichen Hemisphäre aufweisen.

Außerdem sollten sie alle etwa gleich groß sein, was einem Durchmesser zwischen 1,2 und 1,4 Millimetern entsprechen würde. Sammeln Sie etwa zwei bis 300 Zyten für jede Injektion, was etwa 1000 Zyten pro Experiment entspricht. Die Qualität der Website O ist ein Schlüssel zum Erfolg.

Wenn die Oside während der Zubereitung eine Anomalie aufweisen, empfehle ich Ihnen, einen Eierstock aus einer anderen Herde zu korrigieren und erneut zu beginnen. Zur Vorbereitung der Injektion des Antisense-Oligos wird der Metallkolben eines Mikroinjektors in die niedrigste Position gebracht und eine mit Öl gefüllte Glaskapillare auf den Metallkolben eingeführt. Schneiden Sie unter einem Präpariermikroskop die Spitze der Nadel mit einer kleinen chirurgischen Schere ab.

Machen Sie ein kleineres Trinkgeld wie möglich. Nächster Laser. Ein Streifen Paraform auf dem Mikroskoptisch und darauf Drei Mikroliter Nukleinsäurelösung in einer Höhe von einem Mikrogramm pro Mikroliter abgeben.

Füllen Sie damit die Nadelspitze. Wenn Luft eingeschlossen wird, sollte die Öffnung vergrößert werden. Machen Sie nun etwa einen halben Millimeter von der Spitze entfernt eine sichtbare Markierung auf der Injektionsnadel.

Fahren Sie dann mit der Injektion der Zyten fort, um zuerst einen zu injizieren, finden Sie einen Bereich frei von Follikelzellen, in den die Nadel eindringen kann. Führen Sie die Spitze entlang der Äquatorgrenze ein, indem Sie auf den Mittelpunkt unter dem Keimbläschen zielen. Stabilisieren Sie gleichzeitig den Zyten mit einer Pinzette auf der gegenüberliegenden Seite.

Werfen Sie nun mit dem Fußschalter die Lösung aus, werfen Sie zwischen 4,6 und 9,2 Nanogramm Antisense-Oligos oder zwischen 250 Pikogramm und 13,8 Nanogramm Boten-RNA aus. Nachdem Sie alle Zyten injiziert haben, überführen Sie sie in das Inkubationsmedium und lassen Sie sie einige Tage inkubieren, damit Veränderungen stattfinden können. Im Proteasom.

Später werden die Cyten mit einer minimalen Menge an Medien in sechs Zentimeter große, mit Agros beschichtete Schalen mit fünf bis acht Millilitern Reifemedium überführt. Lassen Sie dann die Zyten 16 Stunden lang in diesem Medium entwickeln, bevor Sie ihnen Sperma injizieren. Für dieses Protokoll muss gefrorener Samenbestand vorbereitet werden.

Konsultieren Sie das Textprotokoll nach 16 Stunden Inkubation für die Reifung. Übertragen Sie die Zyten sehr vorsichtig in eine sechs Zentimeter große, mit Ei überzogene Schüssel mit MBS plus PS, um sie abzuwaschen. Wenn die Zyten falsch behandelt werden, können sie spontan vor dem ixy aktiviert werden.

Zählen Sie nun die gereiften Zyten und suchen Sie nach weißen Flecken, die darauf hinweisen, dass das Keimvesikel des Zyten abgebaut ist. Wenn weniger als 80 % gut sind, sind sie insgesamt nicht gesund genug, um das ixy-Verfahren zu überleben. Um fortzufahren.

Füllen Sie eine neue Schale mit Injektionsmedium und geben Sie nach einer halben Stunde alle Zyten vorsichtig in die Schale. Fahren Sie mit der Injektion der reifen Zyten mit Samenlösung fort, wobei das gleiche Injektorpräparat verwendet wird, das für Oligos beschrieben wurde. Idealerweise sollten sich ein bis zwei Spermien pro 4,6 Nanoliter in der Injektionslösung befinden.

Um diese Injektionslösung zu testen, stellen Sie Tropfen DPI-Lösung mit 0,3 Mikrogramm DPI pro Milliliter her und injizieren Sie 4,6 Nanoliter in diese Tropfen. Zählen Sie dann die Anzahl der Spermien in jedem Tropfen durch Fluoreszenzmikroskopie. Nachdem Sie die Spermienkonzentration bestätigt haben, injizieren Sie die Zyten mit 4,6 Nanolitern der Samenlösung.

Stellen Sie sicher, dass die für die Injektion der Lösungen erforderliche Zeit konstant bleibt und injizieren Sie die Eizellen gleichmäßig mit minimalen Pausen zwischen den Injektionen. Nach jeweils 100 Injektionen wird die Samenlösung ausgetauscht. Nachdem alle gereiften Eizellen injiziert wurden, sollte die Schale vier bis fünf Stunden lang inkubiert und dann inspiziert werden.

Bei Embryonen, die sich einer Spaltung unterzogen haben, sind die Spaltfurchen möglicherweise nicht so klar wie bei normal befruchteten Embryonen. Übertragen Sie alle gespaltenen Embryonen auf ein Inkubationsmedium und lassen Sie sie über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag sollten die überlebenden Embryonen in die 0,1 XMMR Embryonalentwicklung von ixy Embryonen überführt werden. In guten Experimenten wurde die Verwendung von in vitro gereiften Eizellen untersucht, fast 100% der keimförmigen Vesikel-Eizellen reagierten auf Progesteron und zeigten Reifungserscheinungen.

Etwa 25 % wurden gespalten. 60 bis 80 % der gespaltenen Embryonen erreichten das Blast-Gast-Stadium, und etwa ein Drittel von ihnen erreichte das Schwimmkaulquappenstadium. Die ixy-Embryonen waren eine Mischung aus normalen und abnormalen Embryonen, was zeigt, dass die Injektion des Antisense-Sogo in die keimförmigen Zyten, gefolgt von IVM und Dixie, eine frühe Embryonalentwicklung ermöglichte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mütterliche Proteine vor der Faktorisierung manipuliert.