Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Developmental Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

הנדסה גנטית של אורגניזמים מודל
 
Click here for the English version

הנדסה גנטית של אורגניזמים מודל

Overview

טרנסגנזה, או השימוש בהנדסה גנטית לשינוי ביטוי גנים, נמצא בשימוש נרחב בתחום הביולוגיה ההתפתחותית. מדענים משתמשים במספר גישות כדי לשנות את תפקוד הגנים כדי להבין את תפקידם בתהליכים התפתחותיים. זה כולל החלפת גן עם עותק לא מתפקד, או הוספת תג חזותי לגן המאפשר מעקב אחר חלבון ההיתוך שנוצר לאורך כל הפיתוח.

בסרטון זה, הצופים ילמדו על העקרונות שמאחורי טרנסגנזה, כמו גם על הצעדים הבסיסיים להכנסת מבנים גנטיים לחיה ומיקוד גנים מעניינים. לאחר מכן הדיון בפרוטוקול ליצירת עכברי הסתרה. לבסוף, כמה יישומים ספציפיים של טכנולוגיות מהונדסות בתחום הביולוגיה ההתפתחותית ייבדקו.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הנדסה גנטית היא כלי רב ערך המשמש לשינוי גנומים של אורגניזמים מודל בתהליך המכונה טרנסגנזה. בביולוגיה התפתחותית, גישה זו משמשת לעתים קרובות כדי לבטא גנים מותאמים שניתן לדמיין ברקמות חיות. לחלופין, ניתן להשתמש בהנדסה גנטית כדי למנוע או לשבש ביטוי חלבון כדי לחקור את התפקוד ההתפתחותי של גנים ספציפיים.

וידאו זה יסכם את העקרונות העומדים מאחורי טכנולוגיה זו, לסקור כמה הליכי הנדסה גנטית, ולהדגיש דרכים שבהן טכניקות אלה משמשות במעבדה.

בתור התחלה, בואו נחקור כמה מושגים חשובים שבבסיס טרנסגנזה. זה כרוך בהחדרת DNA לגנום של אורגניזם מודל. ישנן מספר גישות בהתאם למטרת המחקר.

ראשית, תוספת של גן שונה עשויה לחשוף שינויים תפקודיים או מורפולוגיים עקב מוטציה. שיטה נוספת היא להכניס עותקים נוספים של הגן הפראי ללא שינוי כדי לחקור את ההשפעות של ביטוי יתר, אשר לעתים קרובות יכול להיות מזיק בדיוק כמו מוטציה. גישה שונה היא להכניס חלבון היתוך המכיל תג ניתן להמחשה, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק, כדי לעקוב אחר המיקום והתזמון של ביטוי גנים בבעלי חיים.

פלח הדנ"א שיוכנס לגנום חייב להיות מתוכנן בקפידה כדי לייצר את דפוסי הביטוי והתוצאות הרצויים. המקדם, שהוא אלמנט רצף המכתיב מתי והיכן הגן בא לידי ביטוי, הוא מרכיב מכריע. מקדמים מסוימים באים לידי ביטוי בכל מקום כמעט בכל הרקמות, בעוד שאחרים פעילים רק ברקמות ספציפיות. מקדמים לא מושרים, המופעלים על ידי ניהול כימי או חשיפה לטמפרטורות גבוהות, יכולים לשמש גם כדי לשלוט בתזמון ביטוי הגנים.

כדי להתבטא ביציבות ברקמות, טרנסג'ן חייב תחילה להשתלב בגנום. כדי להשיג זאת, טרנסג'נים יכולים לכלול רצפי דנ"א מאגפים התואמים לאזורים בגנום של האורגניזם. זה מאפשר לטרנסג'ן להשתלב עם ה- DNA המארח באמצעות תהליך המכונה רקומבינציה הומולוגית. לחלופין, במינים מסוימים אלמנטים מיוחדים הנקראים טרנסג'נסיס יכולים לייעל יותר על ידי הכללת אתרי זיהוי עבור טרנספוסאז האנזים, מה שמזרז החדרה אקראית של הטרנסג'ן לגנום.

עכשיו שאתם יודעים כמה מהיסודות של עיצוב טרנסג'נים, בואו נסקור איך ליצור חיה מהונדסת. כדי להפוך את המבנה transgene, להתחיל על ידיגברת הגן של עניין באמצעות PCR. אזור מוגבר זה משוכפל לאחר מכן לווקטור, שהוא פיסת דנ"א שיכולה לשאת את הטרנסג'ן לתאים. וקטורים מכילים בדרך כלל אלמנטים המאפשרים הגברה טרנסג'נית יעילה באמצעות חיידקים, כגון E. coli. לאחר שלב הגברה זה, הווקטור מטוהר מתרבית החיידקים.

בעלי חיים מהונדסים מיוצרים על ידי הזרקת DNA מטוהר לעוברים. בדגים וצפרדעים, מבנים מוזרקים בדרך כלל ישירות לתוך החלמון או הציטופלסמה של עוברים בשלב של תא אחד. עבור טרנסגנזה בתיווך טרנספוסון, תעתיק קידוד האנזים transposase מתווסף לתערובת ההזרקה.

בעכברים, transgenesis יכול להתבצע על ידי מניפולציה של ביצים מופרות לאחרונה שבו זרע וביצית pronuclei עדיין לא התמזגו. המבנה מוזרק ישירות לתוך פרונוקלוס גדול יותר, שם הוא עשוי להשתלב בגנום כמו התא מתחלק. לאחר מכן יש להשתיל את הביצים ברחם של נקבה פסאודו-פרגנית להתפתחות.

יעילות Transgenesis משתנה, ולכן בעלי חיים חייבים להיות מוקרנים כדי לזהות צאצאים שבהם המבנה השתלב בהצלחה בגנום. זה יכול להיעשות על ידי חיפוש תג פלואורסצנטי שהוכנס לזיהוי קל, או באמצעות ניתוחים מולקולריים כגון PCR של DNA גנומי מבודד מחתיכות רקמה קטנות.

גישה שנייה להנדסה גנטית מתמקדת במיקוד גנים ספציפיים כדי לשבש את תפקוד הגנים. ישנן גישות מרובות להשגת מטרה זו. שיטה חדשה יחסית, המכונה עריכת גנום, מנצלת אנזימים ספציפיים לרצף הנקראים גרעינים, החותכים את עמוד השדרה של ה- DNA וגורמים למוטציות בגנים כאשר הדנ"א מתוקן.

שיטת פילוח נוספת כוללת שימוש רקומבינציה הומולוגית כדי להחליף גן בדנ"א זר או בעותק של הגן המוקפים ברצפי זיהוי לאנזימים המכונים רקומבינסים. כאשר רקומבינסות נוכחים, הרצף האגף יהיה נקטע מהגנום. זה ידוע בשם נוקאאוט מותנה, ושליטה של כריתת גנים ניתן להשיג על ידי ביטוי האנזים ברקמות ספציפיות או בנקודות זמן מסוימות.

בואו נסקור הליך כללי ליצירת עכברי נוקאאוט על ידי רקומבינציה הומולוגית. כאן, מבנה חייב להיות מוכן שבו חלק מרצף ה- DNA הגנומי מוחלף בדנ"א זר. דנ"א זה מקודד לעתים קרובות גן אחר, כגון עבור עמידות לאנטיביוטיקה, המספקת דרך לבחור תאים שהשתנו בהצלחה בשלבים מאוחרים יותר.

כדי להתחיל את ההליך, תאי גזע עובריים נאספים ממסת התא הפנימי של עובר עכבר מוקדם המכונה blastocyst. המבנה הליניארי מועבר לאחר מכן לתאי הגזע באמצעות אלקטרופורציה, שבה פולסים חשמליים יוצרים נקבוביות חולפות בקרום התא. לאחר מכן התאים מורשים לדגור בנוכחות אנטיביוטיקה כדי לחסל תאים ללא transgene.

לאחר שלב בחירה זה, ניתן להזריק את תאי הגזע לעובר עכבר אחר בשלב blastocyst. לאחר מכן עוברים העוברים לרחם של עכברה כדי להמשיך בהתפתחות. הגורים המתקבלים יהיו כימרות, המורכבות הן מתאי בר והן מתאי נוקאאוט. כמה כימרות יהיו תאי נוקאאוט בתוך הנבט שלהם, אשר ישדרו את הגן המשובש כאשר הם גדלו, אשר לאחר מכן להקים קו נוקאאוט חדש.

למדתם את היסודות של הנדסה גנטית של מודלים התפתחותיים, אז עכשיו בואו נסתכל על כמה יישומים מעשיים.

מחקרים התפתחותיים משתמשים לעתים קרובות בחלבונים מתויגים פלואורסצנטית כדי לזהות תאים וללמוד את התפתחותם. באמצעות מקדמים ספציפיים לרקמות, אורגניזמים מהונדסים יכולים להיות מהונדסים לבטא חלבונים פלואורסצנטיים בתאים ספציפיים, כמו הסמל העצבי. באמצעות טכניקות הדמיה מתקדמות, ניתן לדמיין את תאי הפלואורסצנט בזמן אמת, ומאפשרים לחוקרים לדמיין באופן ישיר אירועים התפתחותיים מורכבים.

שימוש חשוב נוסף בהנדסה גנטית הוא לחקור גנים ספציפיים ואת תפקידם פנוטיפים מחלות. כאן, מוטציות ממוקדות מוצגות לגן עכבר מסוים באמצעות גרקלאזים, כגון TALENs. PCR מראה אם לעכבר יש אפס, עותק אחד או שני עותקים של הגן שעבר מוטציה. כעת ניתן לחקור בפירוט את העוברים הנושאים שני עותקים מוטנטיים כדי לקבוע את התפקוד ההתפתחותי של הגן.

באמצעות נוקאאוטים מותנים, מדענים יכולים לקבוע את הפונקציה של גן בתוך קבוצה מוגבלת של תאים. כאן, גן מוקף loxP בא לידי ביטוי לאורך כל העובר, אבל Cre בא לידי ביטוי בתאי אנדותל בלבד, גרימת מחיקת גנים בלב וכלי הדם. נוקאאוט ספציפי לרקמות זה הביא לשינוי ניכר בקצב הלב העוברי, וממחיש כיצד לבדוק את התפקיד המקומי של גן מבלי לשנות את האורגניזם כולו.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לטכנולוגיה מהונדסת. טכניקות אלה עוזרות לך להבין את היסודות של הנדסה גנטית, חלק מהשיטות המעורבות, וכיצד היא מיושמת במדע היומיומי. הנדסה גנטית יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על פני אורגניזמים רבים, ותמשיך להיות כלי חשוב לחקר והבנת תפקיד הגנטיקה במחלות התפתחותיות, כמו גם אלה המופיעות במהלך הבגרות. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter