תפוקה גבוהה Danio rerio Assay הוצאה אנרגיה

המטרה הכוללת של בדיקה פלואורומטרית מבוססת רזזורין בתפוקה גבוהה היא לנטר את ההשפעה של מניפולציות גנטיות או פרמקולוגיות על ייצור NADH2, שהוא מדד לקצב חילוף החומרים. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום ההשמנה, כגון ההשפעה של תרופה או גן נתון על קצב חילוף החומרים. בנוסף, ניתן ליישם בדיקה זו כדי לסנן אינטראקציות פוטנציאליות בין תרופות או תרופות-גנים במערכת של בעלי חיים שלמים.

היתרון העיקרי של בדיקה זו, ביחס למבחני צריכת חמצן, הוא התפוקה הגבוהה והצטברות האות לאורך זמן, מה שמאפשר למשתמש לזהות הבדלים קטנים בקצב חילוף החומרים. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה קרוליין פוי, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי. לאחר הכנת תמיסת מלאי 60X של מדיום E3 על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו מדיום 1X E3 על ידי דילול 16.5 מיליליטר מלאי וליטר מים מזוקקים כפולים.

לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של 1% מתילן כחול. כדי להכין פיפטה חד פעמית לק להבה להעברת ביצים ודגים, השתמש במספריים כדי לחתוך פיפטה חד פעמית מדורגת בסיום של 0.25 מיליליטר. לאחר מכן, כדי להסיר את הקצוות המחוספסים, השתמש במבער בונסן כדי להליט את הקצה החתוך.

לאחר הקמת מעברי דג זברה ואיסוף ביצים, הניחו לביצים להתיישב לתחתית המנה, ושפכו את המים. השתמש בפיפטה חד פעמית בעלת קצה דק כדי להסיר את שאריות המים. לאחר מכן הוסף בחזרה את מדיום E3.

דגרו על הדג העוברי בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד ארבעה ימים לאחר ההפריה, או DPF. פעמיים ביום השתמש בפיפטה חד פעמית מדורגת מלוטשת להבה כדי להסיר ביציות לא מופרות או עוברים מתים. ואז פעם ביום שפכו את מדיום E3.

השתמש בפיפטה בעלת קצה דק כדי להסיר את כל המדיום שנותר, והחלף ב-E3 טרי שחומם מראש ל-28.5 מעלות צלזיוס. כדי לבצע את בדיקת הוצאות האנרגיה, הכן את פתרון הבדיקה, לפי טבלה זו. השתמש במסנן של 0.22 מיקרומטר כדי לסנן לעקר את התמיסה, ולחמם ל -28.5 מעלות צלזיוס באמבט מים לצורך הבדיקה.

בצלחת פטרי, שלבו את כל עוברי דג הזברה הקיימים מהמצמד. לאחר עיקור מסנן של 75 מיליליטר של מדיום E3, השתמש בפיפטה חד פעמית בעלת קצה דק כדי להסיר כמה שיותר ממדיום E3 מצלחת הפטרי. הוסף בחזרה 20 מיליליטר E3 סטרילי. לאחר מכן הסר והחלף את ה- E3 הסטרילי פעמיים נוספות.

לאחר מכן, בעזרת פיפטת העברה חד פעמית מפלסטיק מדורגת מלוטשת להבה, העבירו דגים עובריים בודדים לבארות של צלחת בת 96 בארות. בעבודה עם עמוד אחד של הצלחת בכל פעם, הסר את מדיום E3 משמונה הבארות של העמודה הראשונה, הקפד לא לגעת בעוברים עם פיפטת ההעברה. לאחר מכן הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת בדיקה לכל באר.

חזור על הפעולה עם כל 12 עמודות הצלחת. כדי לכלול טיפול תרופתי, לאחר הכנת תמיסה פי 100 של התרכובת הרצויה, הוסף שלושה מיקרוליטר לכל אחת מבארות הטיפול. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים של בקרת רכב לבארות הבקרה של הדגים.

כדי להבטיח שתגובת הקרינה לתרכובת היא תוצאה של פעילות בתוך הדגים, הגדר טיפולי תרופות וכלי רכב לשלוש בארות ריקות כל אחת בצלחת של 96 בארות. כעת, באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי, עם אורכי גל עירור ופליטה של 530 ננומטר ו-590 ננומטר בהתאמה, קראו את הבארות של צלחת הדגים. מניחים את הצלחת בחממה לחה בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.

בהתאם לבדיקה וליציבות התרכובת הנבדקת, קרא שוב את הקרינה בנקודת זמן שנקבעה מראש. כדי להעריך את השינוי היחסי בקרינה, חשב את השינוי הממוצע בקרינה עבור בארות הבקרה. לאחר מכן חלקו את השינוי בקרינה של כל באר בשינוי הממוצע בקרינה של בארות הבקרה.

הנה דוגמה לשימוש בשני עמודים של צלחת 96 בארות. בארות עמודה A כוללות דג זברה שטופל ברכב, בעוד שבארות עמודה B כוללות דג זברה שטופל באינסולין. בטבלה A, הקרינה שנמדדה בזמן אפס מוצגת.

טבלה B מכילה את הקרינה שנמדדה 24 שעות לאחר מכן. בטבלה C, הקרינה בזמן אפס הופחתה מהפלואורסצנטיות ב-24 שעות כדי להעריך את השינוי בקרינה. לאחר מכן, חשב את השינוי הממוצע בקרינה בבארות בקרה.

טבלה D היא השינוי בקרינה של כל באר בודדת, חלקי השינוי הממוצע בבארות הבקרה. אתם יכולים לראות כאן שטיפול באינסולין ב-10 מיקרו-מולרי גרם לעלייה של פי 2.77 באות שנוצר על ידי דג הזברה במשך 24 שעות בערך P של פחות מ-0.0001. כפי שניתן לראות כאן, תמיסת הבדיקה אינה משנה צבע או רמות פלואורסצנטיות מוחלטות בהיעדר עוברים.

עם זאת, הבדיקה רגישה מאוד לשינויים קטנים בקצב חילוף החומרים בתוך הבאר. נתון זה מייצג אותות שנוצרו על ידי אמנון עוברי לאחר דגירה של 24 שעות. בארות ורודות מעידות על דגים עם קצב חילוף חומרים גבוה.

בארות סגולות מכילות דגים עם קצב חילוף חומרים מתון, והבארות הכחולות מייצגות קצב חילוף חומרים נמוך. זה גם מראה את הרבגוניות של הבדיקה והיישום הזה על פני מיני טלאוסט. מכיוון שההפחתה הנגרמת על ידי NADH2 של אלמר כחול אינה הפיכה, האות מצטבר עם הזמן, מה שמאפשר להגביר שינויים קטנים.

מוצג כאן השינוי היחסי בקרינה שנגרם על ידי דג אחד עד חמישה בשעה, שעתיים וארבע שעות. עם כל עלייה במספר הדגים, השינוי היחסי בקרינה גדל משמעותית עם הזמן, וככל שמספר הדגים גדול יותר, כך גדל גודל השינוי הקרינה עם הזמן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו על עד 5,000 דגים עובריים ביום.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להקפיד להימנע מפגיעה בדג העוברי. לאחר ביצוע בדיקה זו, ניתן לבצע הליכים אחרים כמו מדידת אדום הנילוס של שומנים ניטרליים, או מדידת הנעה פאגית באמצעות צריכת פלואוראסיה המסומנת paramecium. זה מאפשר לנו להשוות את הקשר בין קצב חילוף החומרים לחילוף החומרים של השומנים, או קצב חילוף החומרים והדחף הפגי.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חילוף החומרים האנרגטי ומחלות מטבוליות לחקור את הוצאת האנרגיה בדגי הזברה ללא מגבלות בתפוקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במגיב הפלואורומטרי רזזורין כדי למדוד את ייצור NADH2 בדג הזברה.