Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için

Bu deneyin genel amacı, hücresiz bir tahlilin basitliğinde, mitozun sonunda olduğu gibi kromatin de yoğunlaşmayı aslına uygun olarak yeniden oluşturmaktır. Bu yöntem, kromatinin moleküler mekanizmasının karakterizasyonunu, dekolonizasyonu ve düzenlemede yer alan faktörün tanımlanmasını sağladığı için mitoz araştırma alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, biyokimyasal olarak kolayca manipüle edilebilmesi ve kromatin olabilmesidir.

Dekolonizasyon, diğer hücre döngüsü olaylarından ayrı olarak izole bir şekilde incelenebilir. Başlamak için, mitotik kromatin kümelerini helo hücrelerinden izole edin ve beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi IIC xenopus lavis yumurta ekstraktının hazırlanması için tamponları hazırlayın. Hazırlandıktan sonra, yumurtlamanın neden olduğu kurbağalara 500 uluslararası insan koryonik gonadotropin birimi enjekte etmek için 27 gauge iğne ile donatılmış beş mililitrelik bir şırınga kullanın.

Yumurtaların salınmasını sağlamak için deneyden önceki akşam kurbağaları dorsal lenf kesesinin derisinin altına enjekte edin Bir kez indüklendikten sonra, kurbağaları 1.2 litre mark'ın modifiye edilmiş zil tamponu içeren ayrı tanklarda 13 ila 17 saat boyunca 18 santigrat derecede tutun. Kurbağalar yumurtalarını bıraktıktan sonra, kötü görünen yumurtalarla birlikte zaten aktif olan yumurtaları çıkarın. Tankları 600 ila 1000 mililitrelik cam beherlere doğru şekilde dökerek toplayın.

Yumurtaları sıralamak çok önemlidir, çünkü genel ekstra kalite adıma bağlıdır. Aktive edilmiş lifli ve aksi takdirde kötü görünen yumurtaları çıkarın. Ayrıca sonraki adımlarda, çürük yumurtaları çıkarmaya devam edin.

Yumurtalar çöktüğünde S süpernatanı boşaltın ve ardından beheri taze tamponla yeniden doldurun. Son yıkamadan sonra yumurtaları yıkamak için bu işlemi dört kez tekrarlayın. Sırtı bir kez daha çıkarın ve ardından yumurtaları ayırmak için beheri %2 L'lik bir sistein solüsyonu ile doldurun.

İki ila dört dakika sonra, L sistein içeren taze tampona geçin. Yumurtaların hacmi büyük ölçüde azaldığında ve yumurtalar yaklaşık beş ila yedi dakika sonra daha yoğun bir şekilde paketlendiğinde jelleşmeyi tamamlayın. Daha sonra, yumurtaları mark'ın modifiye edilmiş zil tamponunda dikkatlice yıkayın, tampon supinatı doğrudan yumurtaların üzerine değil, beherin duvarına boşaltıp yeniden doldurarak.

Daha sonra yumurtaları, mililitre başına iki miligramlık sekiz mikrolitre içeren 100 mililitre Marx modifiye zil tamponunda etkinleştirin. Kalsiyum iyonu. Dördüncüsü, hayvan kapağı kasılması görünür hale geldiğinde aktivasyonu durdurun.

Veya aktivasyonu takip ettikten 10 dakika sonra, yumurtaları mark'ın modifiye edilmiş zil makinesinde dikkatlice yıkayın, son yıkamadan sonra tampon supinatını boşaltıp yeniden doldurarak tamponlayın. Yumurtaları oda sıcaklığında, mark'ın modifiye edilmiş zil tamponunda 20 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 50 mikrolitre sükroz tamponu, 50 mikrolitre 100 kat proteaz inhibitörü ile beş mililitre santrifüj tüpü hazırlayın.

Beş mikrolitre bir molar DTT, 12.5 mikrolitre siklo heide ve 2.5 mikrolitre sitoyu karıştırın. B. Yumurtaları soğuk sükroz tamponu ile iki kez yıkayın ve ardından santrifüj tüplerine aktarın. Santrifüjlemeden sonra, plastik bir mera pipeti kullanarak, plastik bir mera pipeti kullanarak fazla tamponu plastik bir mera pipeti kullanarak yumurtaları paketleyin ve fazladan odayı daha fazla yumurta ile doldurun.

Daha sonra yumurta dolu tüpleri altı x beş mililitrelik bir rotorda dört santigrat derecede ve 21.000 kez g'de 20 dakika santrifüjleyin. Çözelti şimdi üç katmana ayrıldıktan sonra, 16 gauge iğne ile beş mililitrelik bir şırıngayı tüpün yanından ve üstteki sarı yumurta sarısı ile alttaki koyu kırık yumurta döküntüsünün hemen üzerindeki orta katmana itin. Düşük hızlı fazik ekstraktı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın ve ardından 10 mikrolitre 100 katlı proteaz inhibitörü ekleyin.

Bir molar DTT'nin bir mikrolitresini 2.5 mikrolitre siklo heide'yi mililitre başına 20 miligramda ve 0.5 mikrolitre cyto B'yi karıştırın. Düşük hızlı ekstraktın her mililitresine mililitre başına 10 miligram ekleyin. Düşük hızlı fazik ekstraktı 10 x iki mililitrelik bir rotorda 355.000 kez G'de 12 dakika döndürün. Daha sonra üstteki lipit tabakasını nazikçe çıkarın ve yüksek hızlı ekstraktı içeren sırtı taze bir tüpe aktarın.

Bu adım, yüksek kaliteli bir numune üretmek için kritik öneme sahiptir. Çıkarılan sıvının üstteki lipit tabakasından veya rahatsız edici alt tabakadan kontaminasyon içermemesine dikkat edin. 18 mikrolitre yüksek hızlı ekstraktı 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne pipetleyin ve ardından 0,5 mikrolitre glikojen 0,5 mikrolitre enerji karışımı ekleyin.

Üçüncü nokta, altı dimetil pürinin mikrolitresi ve mitotik kümelerin 0.7 mikrolitresi. Dekompansasyon yapan kromatinin kesilmesini önlemek için kromatin eklenir eklenmez reaksiyonu karıştırmak için geniş açıklıklı uçlar kullanın. Karıştırıldıktan sonra, reaksiyon karışımını 20 santigrat derecede iki saate kadar inkübe edin.

Ardından, %4 paraldehit, %0,5 glutaraldehit ve mililitre dpi başına 0,1 miligram içeren 0,5 mililitre buz gibi sabitleyici ekleyerek numuneyi sabitleyin. Geniş bir açıklığa sahip uçları kullanarak, numuneyi buz üzerinde 20 ila 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, 12 milimetrelik yuvarlak kapak fişlerini hacim poli L lizin çözeltisine ağırlıkça %0.1 olarak kodlayın ve kapak fişlerinin afinitesini artırmak için kapak fişlerini beş dakika inkübe edin.

Kromatinle kurutmak için, kapak daha sonra filtre kağıdına kayar. Kuruduktan sonra, kaplanmış kapak fişlerini, kaplanmış tarafı yukarı bakacak şekilde altı mililitrelik düz tabanlı santrifüj tüplerinin dibine ekleyin. Daha sonra 800 mikrolitre %30 sükroz yastığı ekleyin ve tüm sabit numuneyi üstüne koyun.

Numuneyi dört santigrat derecede ve 2.500 kez G'de 15 dakika döndürün. Daha sonra S süpernatantını ayırın ve santrifüj tüpünün dibine 16 gauge iğne ile dikkatlice sokarak kapak fişlerini tüplerden çıkarın. Kapak astarı bir taraftaki iğne tarafından kaldırıldığında, kapak fişini çıkarmak için cımbız kullanın, kapak fişini deiyonize suya batırarak hızlı bir şekilde yıkayın ve ardından filtre kağıdına yan tarafına dokunarak nazikçe kurulayın. Ardından, bir mikroskop lamına bir damla montaj ortamı yerleştirin ve kapağın örnek tarafını indirin.

Montaj ortamının üzerine kaydırın. Kapak kağıdını bir kağıtla nazikçe kurulayın, kapak fişinin kenarını silin, oje ile kapatın ve görüntülenene kadar slaytı karanlıkta tutun. İşte dekompansasyon testinin tipik zaman seyri.

Reaksiyonun başlangıcında görülebilen kromozom kümesi, decon, yoğunlaşır ve tek bir yuvarlak ve pürüzsüz çekirdeğe birleşir. Yumurta özütü sükroz tamponu ile değiştirildiğinde, kromozom kümesi yoğunlaşmış halde kalır, bu da yumurta özütünde dekompansasyon aktivitesinin mevcut olduğunu gösterir. Burada gösterilen deneyde, reaksiyona hidrolize edilmemiş A TP veya GTP analogları eklendi.

Bu katkı maddelerinin her ikisi de yoğuşmayı inhibe eder ve bu aktif işlemin hem A, TP hem de GTP hidrolizine bağlı olduğunu kanıtlar. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik Singapur seviyelerinde yumurta özü hazırlığı için yaklaşık iki saat içinde ve teşvik edici de kolonizasyon testi için üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, başarının kritik olarak ekstrakt kalitesine bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir.

Özellikle bağışıklık sistemi tükenmeleri için bu işlemi takiben taze hazırlanmış ekstrakt kullanılması tavsiye edilir. Hangi faktörlerin dahil olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için immün tükenmeler ve rekombinant proteinlerin eklenmesi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu teknik, mitoz veya nükleer yapı alanlarındaki araştırmacıların önünü açacak ve hayvan hücrelerinde mitozun sonunda olduğu gibi kromatinin insanlıktan çıkmasını keşfetme işlevi görecektir.

Bu videoyu izledikten sonra, ex xenopus karaciğer yumurta özlerinin nasıl hazırlanacağını ve kromatin dekolonizasyonunu yeniden oluşturmak için yöntemin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız. Paraform Hyde, Hyde ve DARPA ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.