Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Analytical Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

פלואורסצנטיות של קרני רנטגן (XRF)
 
Click here for the English version

פלואורסצנטיות של קרני רנטגן (XRF)

Overview

מקור: המעבדה של ד"ר לידיה פיני — המעבדה הלאומית של ארגון

פלואורסצנטיות של קרני רנטגן היא קרינה מושרה, הנפלטת שניתן להשתמש בה כדי ליצור מידע ספקטרוסקופי. מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של קרני רנטגן היא טכניקת הדמיה לא הרסנית המשתמשת בפליטת פלואורסצנטיות המושרה של מתכות כדי לזהות ולכמת את ההתפלגות המרחבית שלהן.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ראשית, יש להכין דגימות דקות, שטוחות ויבשות (אלא אם כן זמין שלב קריוגני מיוחד למיקרוסקופ). לאחר מכן, קרן רנטגן מונוכרומטית ממוקדת נסרקת על פני הדגימה. קרן הרנטגן מתגברת על האנרגיה המחייבת של חלק מאלקטרונים הקונכייה הפנימית לאטומי המתכת, וכאשר אלקטרונים מהמעטפת החיצונית נופלים לתוך המשרות הפנויות האלה, רנטגן שני נפלט על ידי המדגם. בכל נקודה בסריקת הרסטר הזו, ספקטרום פליטת פלואורסצנטיות של קרני רנטגן נאסף על ידי הגלאי.

בספקטרום זה, אורך הגל והעוצמה של כל צילומי הרנטגן הנפלטים על ידי המדגם נרשמים. בהתבסס על האנרגיה האופיינית (בשל המרווח של מסלולית באטום) של פלואורסצנטיות הנפלטת ואת העוצמה היחסית האופיינית של Kα ו Kβ פסגות (למשל, אשר שניהם ידועים), ספקטרום הפליטה יכול לשמש כדי לקבוע הן את זהות המתכות הנוכחיות ואת הכמות.

וידאו זה יסביר את תהליך הכנת מדגם דק ויבש של תאים דבקים המתאימים להדמיית פלואורסצנטיות. תהליך הסריקה של הדגימות יוסבר בקצרה, ותמונה לדוגמה מתוארת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת חלונות הסיליקון ניטריד

  1. השתמש פינצטה הפוכה כדי להרים חלון (חלונות ניטריד סיליקון יתנפץ אם ירד).
  2. הנח חלון על מגלשת זכוכית, צד שטוח למעלה.
  3. דבק חתיכות קטנות של סרט ויסקי לצדי החלון, ולהשתמש אלה כדי לדבוק את החלונות לתחתית צלחת התרבות.
  4. לחטא את החלונות בצלחות תרבות עם קרינת UV. זה יכול להתבצע עם הגדרת crosslink אוטומטי על ארון UV-crosslinking, ואחריו הקרנת UV נוספת תחת מנורת UV במכסה המנוע זרימה למינאר במשך כ 1 שעות.

2. ציפוי התאים על חלונות הסיליקון ניטריד המעוקרים

  1. החזק את המנה עם זה מוטה על זווית 45°.
  2. הוסף מדיה על ידי צנרת לכיוון הצד של המנה לאט להקל על זווית ההטיה כדי לצפות את החלון עם מדיה.
  3. מוסיפים תאים לצלחת התרבות, באותו אופן, ודגרה.
  4. התבונן בתאים מדי פעם באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לקבוע מתי הם מוכנים לשימוש.

3. קיבעון וייבוש של תאים

  1. במכסה המנוע של זרימה למינארית, הסר את המדיה על ידי שאיפה עדינה תוך הטיית המנה כמתואר לעיל.
  2. מוסיפים PBS, צינורות לכיוון הצד של המנה תוך החזקת אותו בזווית. יש להקל באיטיות על זווית ההטיה כדי לצפות את החלון ב-PBS.
  3. הסר PBS עם שאיפה עדינה.
  4. צנרת לכיוון הצד של המנה, והחזקתה בזווית, להוסיף 4% PFA / PBS, pH 7 כדי לכסות את התאים. שמור בתמיסה זו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את תערובת PFA / PBS, ולהיפטר כחומר מסוכן.
  6. הוסף PBS, pipetting כמתואר לעיל.
  7. חזור על שלבים 3.5 ו-3.6 פעמיים.
  8. הסר את PBS על ידי שאיפה עדינה.
  9. הוסף צינורות 20 מ"מ, 200 mM סוכרוז, pH 7.
  10. הסר את צינורות / סוכרוז על ידי שאיפה עדינה.
  11. חזור על שלבים 2.8 ו- 2.9 פעמיים.
  12. כתם במהירות את הקצוות ואת הכניסה האחורית של החלון עם Kimwipe, ולאחר מכן להגדיר את החלון על משטח נקי, כגון מחצלת רשת גומי, להתייבש.

4. הדמיית פלואורסצנטיות של תאים

  1. לאחר הדגימה יבשה, לאמת את נוכחותם של תאים על החלונות באמצעות מיקרוסקופ אור.
  2. השתמש בלק כדי לאבטח את החלונות למחזיק אלומיניום המסופק על ידי קו הקורה.
  3. הכנס את מחזיק האלומיניום להרכבה קינמטית, ולאחר מכן מקם אותו בעמדה בנקודת המוקד של האופטיקה במיקרוסקופ קרני הרנטגן, ובזווית של כ -45° לקרן הרנטגן של האירוע, מותקן על שלבי הננו-מיקום לדוגמה.
  4. צא מאזור מכשיר המיקרוסקופ של קרני הרנטגן (בדרך כלל כלוב עשוי קירות עופרת), ופתח את התריס. נהל את השלבים הנותרים מרחוק.
  5. באמצעות לוחית אזור, או מראות קירקפטריק-באאז, למקד את קרן הרנטגן המונוכרומטית (בדרך כלל 10 keV באנרגיה) עד לגודל ספוט תת מיקרון.
  6. באמצעות שלבי דגימת הננו-מיקום, והצגת המיקום של קרן הרנטגן במדגם באמצעות מצלמת נצנצים מכוילת מראש במורד הזרם, לקבוע את הרוחב והגובה המתאימים של סריקת הרסטר כדי ללכוד נתונים של המדגם.
  7. עם גלאי נדידת סיליקון באורך גל ב 90° לקרן האירוע, וכ -3 מ"מ או פחות מהדגימה, לאסוף ספקטרום בדיקה עם זמן התעכבות של 1-2 שניות.
  8. הצגת ספקטרום הבדיקה, בחר זמן התעכבות מתאים לסריקה, כדי לספק אות לרעש מספיק עבור האלמנטים המעניינים.
  9. בחר רזולוציה מתאימה לסריקה, כזו שאינה קטנה משמעותית מגודל הספוט של הקרן במדגם, ואינה גדולה יותר מתכונות העניין במדגם.
  10. תכנת את הסריקה לתוך תוכנת הסריקה ואסוף את התמונה.

פלואורסצנטיות של קרני רנטגן, או XRF, ספקטרוסקופיה היא טכניקה אנליטית לא הרסנית המשמשת לביצוע ניתוח אלמנטרי של דגימות בטמפרטורת החדר.

ניתן להחיל את XRF על מגוון רחב של דגימות, כולל ביולוגיות, משפטיות, סביבתיות ואפילו יצירות אמנות. הדגימות יכולות גם לקחת מגוון צורות, כגון אבקות, גבישים ונוזלים. ב-XRF, דגימה מופגזת בקרן רנטגן הגורמת לה לפלוט צילומי רנטגן משניים באנרגיה נמוכה יותר, הנקראת קרינה פלואורסצנטית.

למרות שהוא מכונה טכניקת פלואורסצנטיות, XRF שונה ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית מסורתית בכך שהוא אינו משתמש באור הנראה לאנרגיה נמוכה יותר, או במולקולות פעילות אור.

וידאו זה יציג את היסודות של XRF, ולהדגים כיצד לאסוף מפות אלמנטיות של מדגם ביולוגי.

כאשר פוטון של אנרגיה מספקת מתנגש עם אטום, האנרגיה נספגת, מרגש אחד האלקטרונים הקליפה החיצונית. כשהאלקטרון נרגע, הוא פולט פוטון משני, בדרך כלל של אנרגיה נמוכה יותר. תהליך זה ידוע בשם פלואורסצנטיות. שלא כמו פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה יותר, כמו אלה המשמשים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, פוטונים של קרני רנטגן אנרגטיים מספיק כדי לגרש אלקטרונים המוחזקים בחוזקה מקליפה פנימית. אלקטרון מקליפת אנרגיה גבוהה יותר ייפול למשרה הפנויה. פוטון פרופורציונלי להבדל האנרגיה בין שתי הקונכיות משתחרר. כל אלמנט פולט קבוצה ייחודית של פוטונים, או ספקטרום, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את הרכיב ולקבוע את הכמות הקיימת. תופעה זו ידועה בשם פלואורסצנטיות רנטגן.

לאחר איסוף ספקטרום אלמנטלי, ניתן לבודד את אותות האלמנטים בעלי העניין. ניתן לבצע מדידות במיקומים מרובים על-פני דוגמה, וליצור תמונה, פיקסל אחד בכל פעם. תהליך זה נקרא סריקת רסטר. תמונות של כל האלמנטים מעניינים ניתן ליצור לאחר מכן. מפות אלמנטיות אלה מספקות מידע רב ערך אודות המדגם. עם הבנה של XRF, אתה מוכן כעת להכין דגימת תא ביולוגי כדי ליצור מפות אלמנטריות.

כדי להתחיל, ראשית להכין ולחטא חלון nitride סיליקון, אשר יחזיק את המדגם במקום עבור הסריקה. השתמש בטיפול, כפי שהם שבירים מאוד. כוון את החלון כך שהוא יהיה שטוח בצד למעלה. לאחר מכן מניחים את החלון בצלחת תרבות, ודבקים אותו למנה באמצעות חתיכות קטנות של סרט הדבקה.

לבסוף, לחטא את חלון nitride סיליקון עם קרינת UV במשך 1 שעה.

עכשיו שהחלון עבר חיטוי, ניתן לתקן את הדגימה אליו. ראשית, להחזיק את צלחת התרבות בזווית ולהוסיף מדיה לצד של המנה. לאט לאט להקל על הטיה כדי לצפות את החלון. מוסיפים תאים לצלחת באותו אופן, ודגרה.

מעת לעת להתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ אור עד שהם מוכנים לשימוש.

במכסה המנוע של זרם למינאר, שאפו בעדינות את התקשורת מהמנה.

לאחר מכן, לשטוף את התאים עם תמיסת מלח חוצץ פוספט כדי להסיר מדיה עודפת.

שאפו את PBS, ולתקן את התאים עם paraformaldehyde. לאחר 20 דקות, להסיר את התערובת ולהיפטר כמו פסולת מסוכנת.

הסר את החלון מהצלחת, ובמהירות כתם את הקצוות ואת הכניסה האחורית של החלון עם Kimwipe. הגדר את החלון על משטח נקי לייבוש.

לאחר הדגימה יבשה, לאמת את נוכחותם של תאים על החלון עם מיקרוסקופ אור.

באמצעות לק ברור, לאבטח את החלון למחזיק אלומיניום.

הכנס את מחזיק הדגימה להרכבה של המכשיר ולאחר מכן הנח את ההרכבה על שלב המיקום של מיקרוסקופי הרנטגן.

מקם את חלון המדגם בנקודת המוקד של אופטיקת מיקרוסקופ קרני הרנטגן, עם זווית של 45 מעלות לקרן האירוע.

צא מאזור המכשירים ובצע את השלבים הנותרים מרחוק כדי למזער את החשיפה לרנטגן.

פתח את התריס והשתמש באופטיקה כדי למקד את קרן הרנטגן המונוכרומטית לגודל ספוט תת-מיקרומטר.

ניתן לדמיין את מיקום המקום באמצעות מצלמה מכוילת מראש. באמצעות שלבי המיקום, קבע את הרוחב והגובה המתאימים הדרושים לרסטר מעל המדגם.

לאסוף ספקטרום בדיקה של אלמנט עניין עם זמן השתהות של 1 - 2 שניות.

מספקטרום הבדיקות, בחר זמן סריקה מתאים על מנת לספק יחס אות לרעש מספיק עבור אלמנטים מעניינים.

לאחר מכן, קבע את הרזולוציה הדרושה לדגימה. הרזולוציה צריכה להיות קטנה יותר מהתכונות של עניין, אך גדולה יותר מגודל הספוט. לבסוף, תכנת את הסריקה לתוך תוכנת הסריקה, ואסוף את התמונה.

בניסוי זה, מפה אלמנטית של תא בוצעה עבור מספר אלמנטים שונים. מתכות רבות, כגון נחושת, ברזל ואבץ הן חומרים מזינים חשובים בתא, וזוהו בבירור בתוך התא.

על ידי קביעת היכן כל מתכת נמצאת בתא, ניתן לברוח מידע בעל ערך על התהליכים התאיים הרגילים שלה. בנוסף, מחלות מבוססות מתכת ניתן להבין.

פלואורסצנטיות רנטגן משמשת במגוון רחב של תחומים מדעיים. האופי הלא הרסני של XRF מאפשר את השימוש בו בחקר חפצים היסטוריים. היסטוריונים של אמנות משתמשים בטכניקה כדי לקבוע את הפיגמנטים ששימשו במקור ביצירות אמנות. זה יכול לברוח מידע על העבודה, כגון המקור, צבעים כי דהו לאורך זמן, ואת האותנטיות. מדעני זיהוי פלילי משתמשים גם ב-XRF בחקירת זירת הפשע. כאשר אקדח נורה, האזור שמסביב מצופה בשאריות יריית אקדח. שאריות יריית אקדח מכילות אבקת אקדח, פריימר הצתה, ומתכת מהמעטפת והכדור. המידע שנאסף עם XRF יכול לזהות את האשם ואת הנשק בשימוש.

תחום מחקר נוסף שמשאיל את עצמו לפלואורסצנטיות של קרני רנטגן הוא פליאונטולוגיה. כאן, מידע בסיסי נאסף ממאובן טרילוביטים, פרוקי רגליים ימיים שחיו לפני יותר מ-250 מיליון שנה.

על ידי אפיון ההרכב היסודי של מאובנים, ניתן להשיג מידע חדש על חיים שנכחדו מזמן. דגימות שהשתמרו טוב יותר יכולות אפילו לספק את הרכב הרקמות הרכות שהידרדרו מזמן.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לפלורסצנטיות של קרני רנטגן. עכשיו אתה צריך להבין את התיאוריה של ספקטרוסקופיית רנטגן וכיצד לאסוף מידע אלמנטרי ממגוון רחב של מקורות.

תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מפת הפלואורסצנטיות של קרני הרנטגן של תא דבק מוצגת באיור 1. כל פאנל מציג את ההתפלגות של אלמנט מסוים (למשל, נחושת, ברזל, אבץ וכו ') מעל התא. הפאנל שכותרתו 's_a' מראה את ספיגת צילומי הרנטגן.

Figure 1
איור 1. מפת פלואורסצנטיות של רנטגן של תא חסיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הדמיית פלואורסצנטיות של קרני רנטגן יכולה להיות כלי שימושי בתחומים רבים, כולל מדעי הגיאוגרפיה, מדע זיהוי פלילי, מדעי החומרים, הביולוגיה ואפילו בחקר המורשת התרבותית שלנו. במדעי החומרים, זה יכול לעזור למצוא פגמים שבבים וזרזים שנעשו עם מתכות. בעבודת מורשת תרבותית, הוא שימש לזיהוי מתכות רעילות בשיערם של אנשים מתים מפורסמים (למשל, בטהובן), ולזיהוי מקור הצבעים המשמשים באמנות. בביולוגיה, הוא משמש כדי ללמוד את המתכות הטבעיות המבצעות ביוכימיה חשובה. ב- geosciences, הוא משמש לעתים קרובות כדי לחקור אירועים המתועדים בשיא הסלע. שני מאפיינים מסוימים שהופכים הדמיית פלואורסצנטיות של קרני רנטגן לשימושית בתחומים רבים כל כך הם 1) הפריטים הלא הרסניים שלה, כל כך הרבה פריטים נדירים, או בעלי ערך גבוה ניתן לדמיין, ו -2) בעוד הכנת המדגם המתוארת כאן לתאים היא מורכבת - מכיוון שהתאים חייבים להיות מיובשים עבור חומרים רבים כגון סלעים, אמנות או פריטים אחרים, יש מעט מאוד הכנת מדגם נדרש, מלבד זה צריך להיות שטוח ללא אבק. למרות סינכרוטרון נדרש אשר הגישה הטובה ביותר באמצעות שיתוף פעולה עם מדענים במתקנים אלה, הטכניקה יכולה להיות נגישה מאוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter