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Esecuzione della cromatografia 1D a strato sottile
 
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Esecuzione della cromatografia 1D a strato sottile

Overview

Fonte: Laboratorio del Dr. Yuri Bolshan — University of Ontario Institute of Technology

La cromatografia su strato sottile (TLC) è un metodo cromatografico utilizzato per separare miscele di composti non volatili. Una piastra TLC è costituita da un sottile strato di materiale adsorbente (la fase stazionaria) fissato ad un supporto solido appropriato come plastica, alluminio o vetro1. Il campione o i campioni e i composti di riferimento vengono sciolti in un solvente appropriato e applicati vicino al bordo inferiore della piastra TLC in piccoli punti. La piastra TLC viene sviluppata immergendo il bordo inferiore nel solvente in via di sviluppo costituito da un'appropriata fase mobile. L'azione capillare consente alla fase mobile di risalire lo strato adsorbente. Mentre il solvente si muove verso l'alto sulla piastra TLC, porta con sé i componenti di ogni punto e li separa in base alle loro interazioni fisiche con le fasi mobile e stazionaria.

Principles

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La cromatografia comporta la separazione di una miscela di composti distribuendo i componenti tra due fasi2. La fase stazionaria è fissata in posizione mentre la fase mobile è lasciata fluire attraverso la fase stazionaria, portando con sé i componenti della miscela. Le proprietà di composti come la solubilità nella fase mobile e la forza di interazione con la fase stazionaria influenzano la velocità con cui vengono trasportati attraverso il mezzo. Poiché diversi tipi di composti hanno proprietà fisiche diverse, vengono trasportati a velocità diverse che consentono la separazione dei componenti di una miscela.

Questo video dimostrerà la separazione e la visualizzazione di miscele di composti utilizzando la tecnica della cromatografia unidimensionale a strato sottile (TLC).

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Procedure

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1. Piastre TLC

  1. Gli adsorbenti comuni per TLC sono gel di silice, allumina e cellulosa. Le piastre TLC sono disponibili in commercio con una varietà di proprietà. Scegli una piastra TLC e riducila a una dimensione appropriata (circa 5 cm x 5 cm sono sufficienti per la maggior parte delle applicazioni). Per le lastre TLC con supporto in vetro, segnare il vetro usando un righello e un tagliavetro, quindi rompere con attenzione lungo la linea.

2. Individuazione

  1. Sciogliere il campione in un solvente adatto per produrre una soluzione di circa l'1%. Se possibile, il solvente dovrebbe essere non polare. Le frazioni cromatografiche su colonna e altre soluzioni diluite possono essere utilizzate senza diluizione se il soluto è presente ad una concentrazione compresa tra lo 0,2% e il 2,0%.
  2. Segna la linea di base con una matita a circa 1,0 cm dal fondo del piatto. Posizionare le macchie ad almeno 1,0 cm dal bordo della piastra ed etichettarle in modo appropriato.
  3. Le macchie possono essere applicate utilizzando un capillare di vetro. Per individuare la piastra TLC, immergere il capillare nella soluzione per aspirare una piccola quantità di liquido. Toccare delicatamente la punta nella posizione desiderata sulla piastra TLC e rimuoverla immediatamente.
  4. In alternativa, applicare macchie con una siringa a microlitro erogando circa 1 μL di soluzione per ogni applicazione.
  5. Le macchie possono essere applicate successivamente in ogni posizione, facendo attenzione a non disturbare la superficie dell'adsorbente con lo spotter. Lasciare asciugare il solvente tra un'applicazione e l'altro.

3. Scelta di un solvente in via di sviluppo

  1. È preferibile utilizzare il minor solvente polare possibile per una buona separazione. I solventi comuni per le TLC includono esano, acetato di etile, diclorometano e metanolo (Tabella 1).
  2. Un modo conveniente per trovare una fase mobile appropriata è individuare la piastra TLC con un campione. Applicare abbastanza solvente direttamente sul punto per formare un cerchio di solvente di 1-2 cm di diametro. Segna la circonferenza del cerchio. Al momento della visualizzazione un solvente appropriato mostrerà anelli ben separati, con l'anello più esterno a circa il 50% della distanza dal centro al fronte del solvente.
  3. Potrebbe essere necessario regolare la polarità della fase mobile scegliendo due solventi miscibili e testandoli in proporzioni variabili. Esempi di miscele comuni sono gli esani con acetato di etile e il diclorometano con metanolo.

4. Sviluppo

  1. Posizionare la piastra TLC maculata in una camera di sviluppo contenente il solvente di sviluppo appropriato. La linea del solvente deve essere al di sotto della linea di base indicata sulla piastra TLC.
  2. La camera di sviluppo può essere un barattolo con un coperchio o un becher coperto con un foglio di alluminio o un film plastico. Utilizzare il contenitore più piccolo disponibile che ospiterà la piastra TLC.
  3. Non lasciare che il solvente raggiunga il bordo superiore della piastra. Quando il fronte del solvente (il limite in cui termina la parte bagnata dell'adsorbente) si trova a 5-10 mm dalla parte superiore della piastra, rimuovere la piastra TLC dalla camera di sviluppo e contrassegnare il fronte del solvente con una matita prima che il solvente si asciughi.

5. Visualizzazione

  1. Le macchie colorate possono essere visualizzate immediatamente e contrassegnate con una matita. Spesso, le macchie non sono visibili e quindi devono essere visualizzate con qualche altro metodo.
  2. Spesso, l'adsorbente TLC contiene un indicatore fluorescente. Le macchie possono essere visualizzate utilizzando una lampada ultravioletta (UV) portatile. I composti che estinguono la fluorescenza appariranno come macchie scure quando la piastra viene irradiata con luce UV a onde corte (254 nm). I composti fluorescenti produrranno punti luminosi quando irradiati con luce UV di una lunghezza d'onda appropriata. Segna il centro di ogni punto con una matita.
  3. Le macchie possono anche essere visualizzate applicando un reagente di visualizzazione o una macchia sulla piastra TLC. Il reagente di visualizzazione può essere applicato immergendo la piastra nel reagente o pulendo la piastra con un batuffolo di cotone saturo di un reagente non corruosivo.
  4. Una soluzione al 20% di acido fosfomolibdico in etanolo è utile per la visualizzazione della maggior parte dei composti organici. Le macchie appaiono al riscaldamento della piastra con una pistola termica o in un forno.
  5. Altri reagenti possono essere utilizzati per la visualizzazione di specifiche classi di composti. Ad esempio, il reagente di ninidrina viene utilizzato per la visualizzazione degli amminoacidi e la 2,4-dinitrofenilidrazina per aldeidi e chetoni.

6. Analisi

  1. Il fattore di ritardo (Rf) è il rapporto tra la distanza che un composto percorre su una piastra TLC e la distanza percorsa dal solvente. Questo può essere determinato misurando la distanza dalla linea di base al centro del punto e dividendo il valore per la distanza dalla linea di base al fronte del solvente.
  2. L'Rf di un composto è caratteristico delle sue proprietà fisiche e dipende da fattori quali temperatura, dimensione del campione e spessore e attività dell'adsorbente, temperatura e dimensione del campione.
  3. Per confermare che un'incognita è identica a un composto noto, uno standard dovrebbe essere individuato sulla stessa piastra TLC. Sostanze identiche avranno la stessa caratteristica Rf.

La cromatografia su strato sottile, o TLC, è un metodo cromatografico utilizzato per separare miscele di composti non volatili, comunemente usato in chimica organica.

La TLC viene eseguita su una piastra con supporto in vetro o plastica. Una linea di base è contrassegnata sul piatto, insieme alle etichette. La miscela esaminata e i composti di riferimento vengono disciolti in un solvente appropriato e applicati vicino al bordo inferiore della piastra TLC in piccoli punti. La piastra viene posta in un barattolo e un solvente (la fase mobile) separa la miscela in base alle proprietà fisiche di ciascun componente.

Nonostante il fatto che più tecniche di separazione pesanti per strumenti abbiano più potere risolutivo rispetto alle TLC, sono la velocità e il basso costo che rendono TLC una tecnica attraente per l'analisi qualitativa al volo. Questo video dimostrerà la preparazione, il funzionamento e l'analisi della cromatografia a strato sottile.

Le tecniche cromatografiche includono una fase stazionaria e mobile. In TLC, la fase stazionaria consiste in un sottile strato di materiale fissato alla piastra. Il materiale è una sostanza polare, come il gel di silice. La fase mobile è un liquido non polare che si muove verso l'alto dello strato adsorbente per azione capillare. Mentre la fase mobile si sposta verso l'alto sulla piastra, trascina lungo i componenti di ciascun punto, che vengono successivamente separati in base alla polarità.

I composti che sono meno polari trascorreranno più tempo nella fase mobile mentre viene tirato su la piastra. I composti che sono più polari sono più attratti dalla fase stazionaria e quindi non si sposteranno più in alto nella piastra.

La separazione avviene in un contenitore in via di sviluppo. Questi possono essere barattoli con coperchi o becchi ricoperti di foglio di alluminio. Utilizzare il contenitore più piccolo disponibile che ospiterà la piastra TLC per accelerare la separazione.

La fase mobile, o solvente in via di sviluppo, dovrebbe essere il più possibile non polare per una buona separazione. Qui è mostrata una serie eluotropica per gel di silice, un elenco di fasi mobili comuni al fine di aumentare la potenza estrattiva.

È possibile testare contemporaneamente diverse fasi mobili. Su una piastra pulita, individuare il campione disciolto più volte, ad almeno 2 cm di distanza. Applicare abbastanza fase mobile su ogni punto per formare un cerchio di 1-2 cm di diametro.

Segna la distanza percorsa dalla fase mobile. Se la fase mobile non è abbastanza polare, il campione rimarrà vicino al punto iniziale. Se la fase mobile è troppo polare, tutto il campione migrerà con il fronte del solvente. Una fase mobile appropriata mostrerà anelli ben separati, con l'anello più esterno circa il 50% della distanza dal fronte del solvente.

Se necessario, due fasi mobili miscibili possono essere miscelate in proporzioni variabili per ottenere le proprietà desiderate. Qui, una miscela 1:1 di acetato di etile ed esano era troppo polare, ma una miscela 1:20 era opportunamente separata.

Con la fase mobile scelta, sei pronto per iniziare a sviluppare la piastra.

Per iniziare la procedura, tagliare una piastra TLC disponibile in commercio alla dimensione desiderata. Se la lastra ha un supporto in vetro, segnarla con un tagliavetro e rompere con cura lungo la linea.

Con una matita, segna una linea di base a circa 1 cm dal fondo del piatto. Segna la posizione in cui i campioni verranno individuati lungo la linea. Assicurarsi che le macchie siano ad almeno 1 cm dal bordo e a 3 mm di distanza. Etichettali in modo appropriato.

I campioni solidi devono essere sciolti in un solvente adatto. I solventi comuni includono esani, acetato di etile o diclorometano. Utilizzare il solvente meno polare che dissolverà il campione.

Prelevare la miscela campione/solvente con un capillare di vetro. Toccare delicatamente la punta nella posizione desiderata sulla piastra TLC e rimuoverla immediatamente. È importante non disturbare la fase stazionaria.

Mantieni il punto il più piccolo possibile, in quanto ciò porta a una migliore separazione. Se è necessario più campione, i punti possono essere applicati successivamente in ogni posizione. Lasciare asciugare il solvente tra un'applicazione e l'altro. Un flusso d'aria può essere utilizzato per asciugare solventi meno volatili.

La piastra TLC è ora pronta per essere sviluppata. Metti un pezzo di carta da filtro sul fondo del barattolo per aumentare la pressione del vapore. Aggiungere la fase mobile a una profondità che non raggiunge la linea di base. Tappare il barattolo quando non è in uso in modo che i vapori di solvente non fuoriescano.

Posizionare con attenzione la piastra TLC maculata nel barattolo in via di sviluppo. Assicurarsi che la fase mobile sia inferiore alla linea di base. Osserva l'avanzamento del fronte del solvente, il bordo d'avanguardia della fase mobile, mentre si muoverà rapidamente verso l'alto sulla piastra.

Non permettere alla fase mobile di raggiungere il bordo superiore della piastra, poiché le bande del campione inizieranno ad espandersi tramite diffusione. Una volta che il fronte del solvente si avvicina alla parte superiore, rimuovere la piastra dalla camera di sviluppo e contrassegnare il fronte del solvente con una matita prima che il solvente si asciughi.

Se i composti non sono colorati, è possibile utilizzare una lampada UV per visualizzare le macchie. Il composto bloccherà la fluorescenza di fondo della piastra. Impostare la lampada sull'impostazione a onde corte e illuminare la piastra asciutta. Usando una matita, delinea eventuali punti visibili sotto la lampada. Usando una matita, delinea eventuali punti visibili sotto la lampada.

Un'altra possibile tecnica di visualizzazione è quella di utilizzare il permanganato di potassio, un agente ossidante. Usando una pinzetta, immergere la piastra nella macchia di permanganato.

Rimuovere e tamponare la soluzione in eccesso con un tovagliolo di carta. In una cappa aspirante, riscaldare con cura la piastra con una pistola termica per visualizzare i punti. Usa una matita per contrassegnare eventuali punti che appaiono.

Una volta visualizzati i punti, la sostanza di interesse può essere confrontata con gli standard, come mostrato qui. In questo esempio, l'incognita è l'1,3-difenilpropynone, un elemento costitutivo della sintesi organica. Confrontando la banda con uno standard noto e il cloruro di benzoile, uno dei materiali di partenza, è possibile identificare il prodotto.

Il fattore di ritardo, o Rf, viene utilizzato per identificare il composto sconosciuto. L'Rf è il rapporto tra la distanza che un composto percorre su una piastra TLC alla distanza percorsa dalla fase mobile. Il fattore è determinato misurando la distanza dalla linea di base al punto e dividendo per la distanza dalla linea di base al fronte solvente.

L'Rf di un dato composto dipende dalle condizioni utilizzate nell'esperimento, tra cui la scelta del solvente, lo spessore e l'attività dell'adsorbente, la temperatura e la dimensione del campione. Bisogna fare attenzione a mantenere questi fattori coerenti tra gli esperimenti.

Esistono diverse applicazioni della cromatografia a strato sottile.

In questo esempio, è stato studiato il contenuto di triacilgliceridi delle ghiandole sebacee dei pipistrelli. La frazione lipidica superficiale è stata prima separata per polarità su una piastra TLC. La banda di triacilgliceridi è stata quindi rimossa dalla piastra con una spatola. La polvere di silice è stata trasferita in un tubo di microcentrifuga con solvente. Dopo la centrifugazione, la fase stazionaria è stata lasciata sul fondo del tubo, mentre i composti sono rimasti disciolti nel solvente. I triacilgliceridi sono stati poi ulteriormente separati da un'altra proprietà fisica. In questo caso, la seconda dimensione della separazione era la dimensione molecolare.

TLC può anche essere utilizzato per monitorare la progressione di una reazione chimica. In questo esempio, il materiale di partenza della reazione è stato utilizzato come standard e ha eseguito insieme alla soluzione di reazione su una piastra TLC. Questo processo è stato ripetuto a intervalli specifici nel corso della reazione. Con il progredire della reazione, la banda del materiale di partenza è diminuita e la banda del prodotto si è allargata. Quando non c'è stato alcun cambiamento nelle bande, o tutto il materiale di partenza è stato consumato, la reazione è stata completa.

Infine, le piastre TLC possono essere utilizzate nei saggi biologici. In questo esempio, i composti sono stati separati dal trifoglio rosso con TLC. Ogni fascia è stata poi posizionata su batteri che crescono su piastre di agar. Le molecole che hanno mostrato una crescita batterica inibita sono state ulteriormente analizzate per le loro proprietà antimicrobiche.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla cromatografia a strato sottile. Ora dovresti capire la teoria alla base della separazione, come scegliere una fase mobile appropriata per il tuo esperimento e come impostare e utilizzare una piastra TLC. Grazie per l'attenzione!

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Results

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Un esempio di una tipica piastra TLC è mostrato nella Figura 1. Un composto sconosciuto 'A' può essere paragonato agli standard noti da 'B' a 'E'. La determinazione del valore Rf per ciascun componente si ottiene individuando ogni rispettivo composto, sviluppando la piastra TLC e la visualizzazione. La Rf del composto sconosciuto 'A' viene calcolata misurando l'altezza dello spot (y) e dividendo per l'altezza del solvente (z). Il confronto di questo valore con l'Rf determinato per ciascuno degli standard consente l'identificazione del composto sconosciuto.


Figura 1. Schema di una piastra TLC. Il fattore di ritardo (Rf) dovrebbe essere coerente tra gli esperimenti fintanto che le condizioni sono mantenute costanti.


Tabella 1. Serie Eluotropic per Gel di Silice. Un elenco di fasi mobili comuni in ordine di aumento della potenza di eluizione.

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Applications and Summary

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TLC ha una serie di applicazioni pratiche in laboratorio. Le TLC possono essere utilizzate per identificare composti sconosciuti e componenti sconosciuti di miscele tramite confronto con gli standard. La TLC è comunemente usata per monitorare il corso di una reazione chimica e per valutare la purezza del prodotto attraverso il confronto di quantità relative di reagenti, prodotti e sottoprodotti su cromatogrammi successivi nel tempo. La TLC può anche essere utilizzata per determinare se una sostanza purificata con altri metodi (come la ricristallizzazione o la distillazione) contiene ancora una quantità significativa di impurità.

Quando composti simili non possono essere risolti con TLC, possono essere ulteriormente separati in base a un'altra proprietà fisica, nota come separazione bidimensionale. In un esempio, la TLC è stata utilizzata per separare ampie classi lipidiche (trigliceridi, steroli, acidi grassi, ecc.) secrete dalle ghiandole sebacee dei mammiferi. Le diverse classi sono state poi ulteriormente separate dalla spettrometria di massa3.

In microbiologia, la TLC viene utilizzata negli screening bioautografici per nuovi composti antimicrobici a base vegetale4. Una volta che i composti sono stati separati da un estratto della pianta in questione, le bande possono essere applicate direttamente alle colture microbiche. Le bande che si osservano inibiscono la crescita vengono quindi ulteriormente studiate come probabili candidati.

La TLC è un metodo semplice per determinare una fase mobile appropriata per la separazione di una miscela mediante cromatografia su colonna. Inoltre, viene utilizzato per determinare la composizione delle varie frazioni raccolte durante una separazione cromatografica su colonna, in modo che le frazioni contenenti il composto desiderato possano essere identificate e raccolte.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

References

  1. Lehman, J. W. The student's lab companion: laboratory techniques for organic chemistry: standard scale and microscale. Pearson College Div, (2008).
  2. Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G. S., & Engel, R. G. Microscale and Macroscale Techniques. Thomson Wadsworth, (2006).
  3. Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, (2013).
  4. Kagan, I. A., Flythe, M. D. Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (85), e51411, (2014).

Transcript

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