Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

ציטוגנטיקה

Overview

ציטוגנטיקה היא תחום המחקר המוקדש לכרומוזומים, והיא כוללת התבוננות ישירה במספר ובמבנה הכרומוזומלי של התא, המכונה קריוטיפ שלו. חריגות כרומוזומליות רבות קשורות למחלה. כל כרומוזום בקאריוטיפ יכול להיות מוכתם במגוון צבעים כדי להעניק דפוסי פס ייחודיים. טכניקות עדכניות יותר, כולל הכלאה גנומית השוואתית ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH), מאפשרות זיהוי תכונות כרומוזומליות ספציפיות או חריגות.

וידאו זה יתחיל בבחינת העקרונות של טכניקות ציטוגנטיקה קלאסיות ומודרניות אלה. לאחר מכן מתבצעת בדיקה של פרוטוקול כללי לביצוע FISH. לבסוף, מוצגות מספר דוגמאות לאופן שבו ניתן להחיל קריוטיפינג על יישומים רפואיים שונים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ציטוגנטיקה היא חקר המבנה והמאפיינים של כרומוזומים, כמו גם התנהגותם במהלך חלוקת התאים ותפקידם בתורשה. כרומוזום, שהוא מולקולה של DNA והחלבונים הקשורים אליו, ניתן לראות תחת מיקרוסקופ בעזרת צבעים ובדיקות. תצפיות כאלה הן גישה רבת עוצמה לאיתור פגמים במבנה ובמספר כרומוזום, הקשורים לעתים קרובות למחלות והפרעות.

וידאו זה יכסה את העקרונות של ציטוגנטיקה, פרוטוקול עבור טכניקה בשימוש נרחב כדי להדגיש תכונות כרומוזום ספציפיות, המכונה פלואורסצנטיות בהכלאה במקום, וכמה יישומים של טכניקה זו.

נתחיל בדיון בחשיבות של ציטוגנטיקה ובעקרונות שמאחורי כמה טכניקות קלאסיות ומודרניות בתחום.

ציטוגנטיקה כרוכה בהתבוננות ישירה במבנה ובמספר הכרומוזום של התא, המכונה "קריוטיפ" שלו. זה עשוי לשמש כדי לזהות סטיות מן הדיפלואיד הרגיל, או מזווג, מספר כרומוזום, אשר נקרא aneuploidy, כמו גם פגמים במבנה כרומוזום.

מחלות והפרעות רבות נובעות ממחלות כרומוזומליות. לדוגמה, כרומוזום פילדלפיה, הנובע מהעברת הדדיות בין חלקים של כרומוזומים 9 ו -22, קשור ללוקמיה מיאלוגנית כרונית. דוגמה נוספת היא טריזומיה 21, הגורם הנפוץ ביותר לתסמונת דאון, שבה עובר בירושה עותק נוסף של כרומוזום 21.

קריוטיפינג מבוצע בדרך כלל על תאים שמתכוננים לחלק, כאשר הכרומוזומים שלהם מרוכזים וניתן להבחין ביניהם בקלות.

ניתן לטפל בכרומוזומים בקריוטיפ בכתמים החושפים דפוסי פס ייחודיים. לאחר מכן ניתן לסדר כרומוזומים מוכתמים לפי גודל וצורה לניתוח קריוטיפ. ניתן להחיל מספר צבעים כדי להדגיש תכונות כרומוזומליות ספציפיות. כתמים עם Giemsa, או G-banding, סימנים צפופים, בדרך כלל אזורים עניים גנים עשירים בבסיסי A-T. פס R הוא כתם Giemsa הפוך המדגיש אזורים כרומוזומליים עשירים בבסיסי G-C. פס C מדגיש את האזורים הכרומוזומליים הצפופים ביותר סביב הצנטרומר, המבנה המצטרף לחצי זהים של כרומוזום משוכפל, ואילו T-banding מדגיש את קצות הכרומוזומים, או הטלומרים.

טכניקה אחרת, הנקראת פלואורסצנטיות בהכלאה במקום, או FISH, מאפשרת זיהוי של כרומוזומים ספציפיים, אזורים של DNA או תמלילי RNA. זה מושגת על ידי דגירה מדגם עם בדיקות אוליגונוקלאוטיד ספציפיות מאוד כי הם מתויגים פלואורסצנטית. מכיוון שניתן להכלא את הבדיקות הללו לכרומוזומים לא מרוכזים בתאים שאינם מתחלקים, FISH עשוי להיות מיושם באופן רחב יותר מאשר שיטות קריוטיפינג קלאסיות.

לבסוף, החוקרים פיתחו גם שיטה הנקראת הכלאה גנומית השוואתית כדי לסנן אזורים כרומוזומליים חסרים או משוכפלים. דנ"א גנומי מנושא בדיקה ובקרה מבודד, מקוטע ומסומן בפלואורופורים צבעוניים שונים. ההכנות הגנומיות המפוצלות מעורבבות ומותאמות באופן תחרותי לממרח כרומוזום רגיל. צבעים ב- karyotype המתקבל מציינים אם אזור משוכפל במדגם הבדיקה, מה שיוצר מקטעים נוספים לאיגוד הכפולה, או אם האזור נמחק, וכתוצאה מכך איגוד מועדף לרסיסי הבקרה הנפוצים יותר.

עכשיו שאתם מבינים את העקרונות של ציטוגנטיקה, בואו נפעיל אותם ונסתכל מקרוב על אופן ביצוע הדגים.

ראשית, רקמות או תאים מבודדים מטופלים עם קיבוע כגון paraformaldehyde כדי לשמר מורפולוגיה כרומוזום ושלמות. לאחר מכן, ממרח כרומוזום מוכן, למשל על ידי שיבוש מכני של החומר. לאחר מכן, הכרומוזומים מיובשים בסדרת פתרונות של ריכוזי אתנול הולכים וגדלים, ומתרחלים לתמיסת פפסין כדי להפוך את רצפי המטרה לנגישים יותר לנגישים יותר לנגישים. לאחר מכן, כרומוזומים נשטפים ומתייצבים עם פוסטפיקס, מנווטים בטופסמיד כך שהדנ"א החד-גדילי כעת יכול לקשור את הבדיקות, ומיובש בסדרה שנייה של פתרונות אתנול מרוכזים יותר ויותר.

בדיקות דנ"א בעלות תווית פלואורסצנטית וספציפיות מאוד מוכנות ומעורבבות עם שברי דנ"א חוזרים על עצמו ללא תווית כדי לחסום כריכה לא ספציפית. לאחר מכן, הגשושית מוחלת על התפשטות הכרומוזום, שם היא מתכלאת לרצף היעד שלה, וגשושית לא מאוגדת מוסרת עם סדרה של שטיפות.

לבסוף, הכרומוזומים מותקנים במדיום המשמר את הדגימה ומכיל כתם DNA כללי, כגון DAPI המסמן דנ"א גנומי ברקע, ומוחל כיסוי. בשלב זה, ניתן לראות את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות ערכות המסנן המתאימות כדי לדמיין DNA גנומי ותכונות ספציפיות לרצף.

לאחר שראה כיצד דגים מבוצעים, בואו נסתכל על כמה יישומים של טכניקה חזקה זו.

דגים עשויים לשמש כדי לאשר כי קריוטיפ של העובר הוא נורמלי לפני ההשתלה. כאן, תא בודד, המכונה בלסטומר, היה ביופסיה מעובר שלושה ימים לאחר ההפריה, ואז lysed ו קבוע ישירות על שקופית מיקרוסקופ. ממרח הכרומוזום היה אז הכלאה לבדיקות שנבחרו במיוחד כדי לזהות הפרעות כרומוזומליות פוטנציאליות. במקרה זה, סטיות מהתבנית הצפויה של אותות הכלאה מצביעות על שיבושים במספר או במבנה הכרומוזום.

טכניקות חדשניות פותחו גם כדי לתייג את כל הכרומוזומים מדגם ביולוגי יחיד. שיטה אחת כזו כוללת את מכשיר אוקטוכרום, שקופית זכוכית בעלת שמונה תאים עמוסה מראש בבדיקות פלואורסצנטיות. כל 22 הכרומוזומים הקובעים שאינם סקס, הנקראים אוטומוזומים, ושני כרומוזומי המין סומנו על ידי הפצתם בין שמונת החלונות, שכל אחד מהם הכיל שלושה פלואורופורים ספציפיים לכרומוזום. זה איפשר הקרנה בו זמנית של כל הכרומוזומים מהכלאה אחת.

לבסוף, במקום להפריד את הבדיקות לחלונות שונים בשקופית, ניתן לתייג את כל הכרומוזומים ואז לזהות אותם יחד באמצעות גישה הנקראת קריוטיפינג ספקטרלי או SKY. בדיקות ספציפיות לכרומוזום מרובות עם תוויות פלואורסצנטיות שונות היברידיות לכל כרומוזום, מה שהעניק לכל אחת מהן צבע ספקטרלי ייחודי. תצפיות בו-זמניות של תערובת הכרומוזומים המשולבת שימושיות במיוחד לזיהוי פגמים בקריוטייפ, וניתן להשתמש בהן לזיהוי אנופלואידיה, כמו גם מחיקות כרומוזומליות ותמרות.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על ציטוגנטיקה. בסרטון זה, למדת על העקרונות של ציטוגנטיקה, טכניקות כגון קריוטיפינג ו- FISH המשמשים להדגשת תכונות כרומוזום ספציפיות, ויישומים של טכניקות אלה. ההתקדמות האחרונה בציטוגנטיקה הגדילה את יכולותיהן במעבדות מחקר ופתולוגיה כאחד, והן ימשיכו למצוא שימוש נרחב בחזית המחקר והאבחון של מחלות. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter