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Overview

Una tecnica consolidata per modificare sequenze specifiche nel genoma è il targeting genico mediante ricombinazione omologa, ma questo metodo può essere laborioso e funziona solo in alcuni organismi. I recenti progressi hanno portato allo sviluppo del "genome editing", che funziona inducendo rotture a doppio filamento nel DNA utilizzando enzimi nucleasi ingegnerizzati guidati a siti genomici bersaglio da proteine o RNA che riconoscono sequenze specifiche. Quando una cellula tenta di riparare questo danno, le mutazioni possono essere introdotte nella regione del DNA mirata.

In questo video, JoVE spiega i principi alla base dell'editing del genoma, sottolineando come questa tecnica si riferisca ai meccanismi di riparazione del DNA. Quindi, vengono esaminati tre principali metodi di modifica del genoma - nucleasi a dita di zinco, TALEN e il sistema CRISPR-Cas9 - seguiti da un protocollo per l'utilizzo di CRISPR per creare cambiamenti genetici mirati nelle cellule di mammifero. Infine, discutiamo alcune ricerche attuali che applicano l'editing del genoma per alterare il materiale genetico in organismi modello o cellule coltivate.

Procedure

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L'editing del genoma comprende tecniche con cui i ricercatori possono "modificare" o modificare una specifica sequenza di DNA. Questi metodi si basano sulla creazione di piccoli "tagli" nel DNA, che le cellule tentano di riparare, spesso in modo incompleto. In questo modo, gli scienziati possono indurre mutazioni in sequenze mirate con maggiore efficienza rispetto al targeting genico classico.

In questo video, esamineremo i principi alla base di tre tecniche di editing del genoma e discuteremo un protocollo generalizzato per una di esse, il sistema CRISPR-Cas9. Esploreremo quindi alcune applicazioni di questi metodi.

Per prima cosa, diamo un'occhiata ai principi alla base dell'editing del genoma.

Il metodo classico per introdurre cambiamenti genetici in sequenze specifiche nel genoma è il targeting genico mediante ricombinazione omologa, in cui l'incorporazione di sequenze omologhe nel costrutto di targeting porta al "switching out" del gene endogeno per una versione alterata.

Come il targeting genico, l'editing del genoma può indirizzare i cambiamenti a specifiche regioni del DNA, ma può farlo con un'efficienza molto più elevata, stabilendo le mutazioni desiderate in più cellule in un dato esperimento.

Tutti i metodi di modifica del genoma si basano sulla capacità di una cellula di riparare le rotture a doppio filamento fatte al suo DNA dalle endonucleasi. Questo danno può essere riparato mediante unione di estremità non omologa o NHEJ, dove le estremità del DNA rotte vengono risigillate direttamente; o tramite riparazione diretta all'omologia o HDR, in cui il danno viene riparato copiando da un modello omologo. NHEJ di solito non è perfetto e potrebbe comportare la cancellazione o l'aggiunta di diverse basi al DNA riparato, mutando così la sequenza target. D'altra parte, l'HDR consente ai ricercatori di aggiungere un modello per indirizzare modifiche specifiche al sito di destinazione.

Tre importanti tecniche di modifica del genoma sono state sviluppate e divulgate negli ultimi anni.

In un metodo, i ricercatori fondono i domini del "dito di zinco" legante il DNA di alcuni fattori di trascrizione al dominio di scissione del DNA dell'endonucleasi di FokI. Poiché ogni dominio del dito di zinco riconosce una specifica tripletta nucleotidica, questi domini possono essere collegati artificialmente tra loro per progettare nucleasi a dito di zinco, o ZFN, che prendono di mira sequenze di DNA uniche.

Allo stesso modo, le nucleasi chiamate "TALENs" uniscono FokI ai domini variabili di legame del DNA delle proteine batteriche chiamate effettori simili ad attivatori di trascrizione o TALE. Ogni dominio TALE riconosce una singola base di DNA unica, dando ai TALEN la loro specificità di sequenza.

Infine, il sistema CRISPR-Cas9 utilizza componenti di un sistema immunitario procariotico che normalmente protegge il suo ospite dall'incursione di materiali genetici estranei, come quelli in virus o plasmidi. In questo sistema, pezzi di DNA estraneo invasore chiamati "protospaziatori" sono incorporati in un locus CRISPR, che viene poi trascritto ed elaborato da macchinari proteina-RNA in piccoli RNA chiamati crRNA.

Gli scienziati stanno sfruttando il macchinario CRISPR per scopi di editing genomico progettando sequenze guida simili a crRNA note come "guida singola" o sgRNA, che possono essere utilizzate per indirizzare Cas9 a quasi tutte le sequenze genetiche desiderate nelle cellule di mammifero o in altri sistemi di interesse. La semplice personalizzazione del sistema CRISPR-Cas9 basato su sequenze di RNA offre vantaggi distinti rispetto ai metodi di modifica del genoma basati su proteine come ZFN e TALEN.

Ora che hai imparato a conoscere i principi alla base dell'editing del genoma, esaminiamo un tipico protocollo di utilizzo di CRISPR per creare cambiamenti genetici mirati nelle cellule di mammifero.

In primo luogo, viene scelta una posizione genomica da modificare. Questa regione deve essere corta - circa 20 coppie di basi di dimensioni - e possedere un "motivo adiacente protospacer" lungo 3 basi o "PAM" alla sua estremità di 3′. Il PAM è necessario affinché Cas9 riconosca e scinde la regione del DNA bersaglio e la sequenza esatta è specifica per l'organismo di origine del Cas9 utilizzato. Una volta che un potenziale sito è stato identificato, dovrebbe essere cercato rispetto alla sequenza del genoma per garantire che siti simili non si trovino altrove nel genoma, e quindi nessuna regione genomica fuori bersaglio sarà modificata.

Per sintetizzare la sequenza guida CRISPR, vengono generati due oligonucleotidi, uno identico e uno complementare alla sequenza target. Sequenze extra sono incluse sulle loro estremità 5′ per la compatibilità con i vettori sgRNA. Questi oligonucleotidi vengono quindi mescolati insieme, denaturati e quindi ricotti.

Successivamente, un plasmide contenente uno "scaffold" sgRNA viene tagliato con l'enzima di restrizione appropriato, miscelato con la sequenza guida CRISPR sintetizzata e incubato con l'enzima ligasi per creare il costrutto sgRNA. Il plasmide può quindi essere trasformato in batteri e coltivato per l'amplificazione. Una volta purificato dai batteri, il costrutto CRISPR viene co-trasfettato con un costrutto che codifica Cas9 nelle cellule il cui genoma deve essere modificato. Queste cellule trasfettate vengono coltivate per formare colonie clonali.

Il DNA genomico può essere isolato da ogni colonia e analizzato mediante PCR o sequenziamento per lo screening di quelli in cui il sistema CRISPR ha prodotto le mutazioni desiderate.

Diamo ora un'occhiata ad alcuni modi in cui gli scienziati stanno usando tecniche di modifica del genoma.

Molti ricercatori usano l'editing del genoma per introdurre sequenze reporter in loci specifici. In questo esperimento, gli ZFN sono stati utilizzati per inserire una proteina fluorescente verde in un gene coinvolto nello sviluppo e nella sopravvivenza dei neuroni. I ricercatori hanno confermato di aver correttamente mirato a questo gene dirigendo le cellule staminali a differenziarsi in neuroni ed eseguendo una doppia immunofluorescenza per GFP e marcatori neuronali.

L'editing del genoma ha anche reso molto più facile generare organismi "knockout" in cui un gene di interesse è reso non funzionale. Qui, i ricercatori hanno cercato di creare topi knockout iniettando embrioni con mRNA che codificano TALEN che prendono di mira geni specifici. Il successivo trattamento con endonucleasi del DNA di topi trattati con TALEN ha permesso ai ricercatori di identificare animali con mutazioni in entrambe le copie del gene bersaglio.

Infine, l'editing del genoma può essere utilizzato per creare grandi delezioni genetiche causando due rotture a doppio filamento nella stessa regione cromosomica. Queste grandi delezioni potrebbero essere necessarie quando la funzione di un gene o di un elemento genetico non può essere eliminata dalle piccole delezioni create con i protocolli convenzionali di modifica del genoma. Qui, i ricercatori hanno co-elettroppato le cellule tumorali del topo con un costrutto GFP e due costrutti CRISPR che mirano a diverse aree all'interno di un gene che guida il cancro. Le cellule che sono state trasfettate con successo, che avrebbero quindi emesso il segnale GFP, sono state isolate mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e la successiva PCR e sequenziamento hanno identificato le cellule in cui la regione del DNA tra i due siti mirati a CRISPR è stata eliminata.

Hai appena visto il video di JoVE sull'editing del genoma. Qui, abbiamo esaminato i principi alla base di ZFN, TALEN e CRISPR, esplorato un protocollo generale CRISPR-Cas9 e discusso di come i ricercatori utilizzano oggi le tecniche di modifica del genoma. Come sempre, grazie per aver guardato!

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