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반응성 산소 종 감지

Overview

반응성 산소 종은 화학적으로 활성, 다른 분자를 산화 할 수있는 산소 유래 분자. 그들의 반응성 성격 때문에, DNA 및 그밖 생물학 분자에 구조적인 손상을 포함하여 확인되지 않은 ROS 생산과 관련되었던 많은 해로운 효력이 있습니다. 그러나, ROS는 또한 생리적 신호의 중재자가 될 수 있습니다. ROS가 전사 요인의 활성화에서 외국 병원체를 죽이고 신체를 방어하는 염증 성 독성의 중재에 이르기까지 모든 것에 중요한 역할을한다는 증거가 축적되어 있습니다.

이 비디오에서 우리는 ROS, 신진 대사 및 질병 사이의 연관성을 탐구할 것입니다. 그들의 중요성을 확립 한 후, 우리는 세포에서 ROS 수준을 측정하기 위한 일반적으로 사용되는 방법론의 원리와 프로토콜, 즉 산화시 형광이 되는 비형광 프로브의 사용에 대해 논의할 것입니다. 마지막으로, 우리는 세포 생물학 연구에서이 기술의 현재 응용 프로그램을 검토할 것입니다.

Procedure

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세포에서 생성된 반응성 산소 종은 조직 항상성, 세포 노화 및 암과 같은 질병 상태에 연루되어 있습니다. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, 이 분자는 산소에서 발생, 자연스럽 게 안정 으로 존재, 모든 전자는 결합 하기 때문에 dioxygen 분자. 페어링되지 않은 전자 1개를 첨가하면 불안정하게 만들고 반응성 산소 종 또는 ROS의 한 형태인 초산화화물 음이온의 형성으로 이어집니다. 초산화화물 음이온 이외에, 결합되지 않은 전자를 가진 반응성 종의 몇몇 모형이 있습니다, 그의 수준은 세포가 단단히 통제하는 것을 목표로 합니다.

이 비디오에서, 우리는 반응성 산소 종이 세포 대사와 질병과 어떻게 관련되는지 배우고, 형광 프로브를 사용하여 검출을위한 분석의 뒤에 있는 원리를 탐구하고, 우리는 이 분석에 대한 일반화된 프로토콜을 통해 갈 것입니다. 마지막으로, 우리는 과학자들이 오늘 실험에서이 방법을 구현하는 방법을 조사 할 것입니다.

먼저 반응성 산소 종이 어떻게 생성되는지 논의하고 세포 대사와 질병에 미치는 영향을 고려해 보겠습니다.

세포 반응성 산소 종의 중요한 근원은 미토콘드리아입니다. 일반적으로 세포 대사 중 전자는 단백질 복합체 체인을 통해 운반되어 분자 산소를 물로 감소시키고 ATP의 동시 발생을 합니다. 이 과정의 특별한 규제에도 불구하고 전자는 누출되어 수퍼옥사이드 애니메이션이 형성됩니다.

과산화수소 및 하이드록실 라디칼과 같은 반응성 산소 종의 다른 형태를 신속하게 발생시키는 초산화수소 음이온의 존재. 이 래 디 칼, 모든 매우 반응 성 결합 되지 않은 전자를 소유, 산화 막, DNA, 그리고 단백질을 손상 시킬 수 있습니다. 이 세포는 자유 라디칼을 줄이는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 또는 비타민 C와 같은 분자와 같은 자체 항산화 비축량을 유지합니다. 이 방어 시스템의 불균형은 잠재적으로 치명적인 긍정적 인 피드백 루프를 초래할 수 있으며, 그 결과 산화 스트레스로 알려진 과도한 반응성 산소 종의 상태가 발생할 수 있습니다.

반응성 산소 종은 암의 개시 및 진행에 연루되었습니다. 이 분자의 또 다른 유해한 효력은 세포 노화의 유도입니다, 또한 노화로 알려져 있습니다. "노화의 자유 급진적 이론"은 정상적인 신진 대사 중에 세포에서 생산된 반응성 산소 종은 세포 노화와 죽음을 불러 일으킨다는 것을 제안합니다.

지금까지, 우리는 이 높게 반응성 분자의 부정적인 양상을 토론했습니다, 그러나 그(것)들은 또한 세포 생리학에 있는 긍정적인 역할이 있습니다. phagocytes가 병원균을 덮을 때 면역 반응 도중, 세포는 산화적으로 병원체를 저하시키기 위하여 반응성 산소 종의 과도한 양이 생성되는 동안 "호흡 파열"을 탑재합니다. 또한, 그들은 다양한 세포 신호 경로의 필요한 중간 및 조절제이며, 심지어 암으로 변한 세포의 죽음을 신호 할 수 있습니다.

이러한 영향력 있는 세포 산화제를 정량화 하기 위해, 과학자는 산화에 형광을 설정 하는 분자를 악용. 반응성 산소 종을 검출하는 데 일반적으로 사용되는 프로브는 H2DCFDA 또는 디클로로 디하이드로-플루오레세인 이아세이테이트, 형광체의 비형광 유사체이다. 세포에 추가될 때, 그 세포는 자연을 퍼감는 자연을 수동적으로 확산할 수 있게 합니다.

그런 다음 세포 내 에스테라아제는 가수 분해 반응을 촉매하여 아세테이트 그룹을 분기시합니다. 이것은 화합물을 더 극성하게 만들고, 세포 내로 유지되도록 합니다. 광범위한 반응성 산소 종에 의해 수소 원자를 제거하는 산화시, 비형광 H2DCFDA는 고형성 디클로로-형광체 또는 DCF로 변환됩니다. 이것은 플레이트 판독기, 유동 세포계 또는 형광 현미경 검사법에 의해 읽고 정량화될 수 있다.

이제 이 분석이 어떻게 작동하는지 알게 되었으므로 실험실 환경에서 어떻게 작동하는지 살펴보겠습니다.

배양 배지에서 자란 세포를 인산염 완충식식염으로 옮기고 원심분리를 통해 세척한다. 상체를 제거하고 형광 프로브 H2DCFDA 솔루션을 추가합니다. 광표백을 방지하기 위해 어둠 속에서 염료가 로드된 세포를 배양합니다. 인큐베이션 후 세포를 씻어 하역 된 염료를 제거하고 세포를 접시에 옮겨넣습니다. 이 시점에서, 실험 산화 스트레스 유도제를 추가할 수 있습니다.

분석을 위해 준비할 때, 세포는 플레이트 판독기에 삽입될 수 있습니다. 여기와 방출 파장이 형광을 위해 설정됩니다. 플레이트를 읽은 후 값을 분석할 수 있습니다. 결과는 특정 시간 점에 견본 사이 반응성 산소 종의 상대적인 양을 보여줍니다.

이제 실제 프로토콜을 검토한 결과, 오늘 실험에서 어떻게 적용되는지 살펴보겠습니다.

연구원은 종종 phagocytosis의 역학을 조사 하기 위해이 방법을 사용. 과학자의 이 단은 발달의 다른 단계에서 면역 반응을 탑재하는 제브라피시의 능력을 공부하고 싶었습니다. 앞서 언급했듯이, phagocytosis는 병원균을 죽이는 데 사용되는 높은 반응성 산소 종 또는 "호흡 파열"의 생성을 초래합니다. 효소 NADPH 산화효소는 식세포에서 중요한 ROS 생산자이기 때문에, 이 과학자들은 NADPH 유도기로 제브라피시를 치료하여 폭발 반응을 유도하였다. 그 결과는 "파열" 반응이 자극된 제브라피쉬 배아 사이에서, 72시간 후 수정에 그(것)들은 48 시간 후 수정에 그들 보다는 더 높은 반응성 산소 종 발달을 보여주었다는 것을 보여주었습니다.

반응성 산소 종 증가로 인한 미토콘드리아 기능 장애는 많은 질병의 병리학적 특징이다. 따라서, 연구원은 산화 스트레스의 수준을 측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능 장애를 식별할 수 있습니다. 여기서 과학자들은 H2DCFDA를 뉴런에 실은 다음 샘플을 형광 현미경에 장착했습니다. 과산화수소와 같은 산화 스트레스를 첨가하여 세포 체는 형광이 급격히 증가하여 미토콘드리아 기능 장애의 징후일 수 있습니다.

성상 세포는 산화 스트레스에서 중추 신 경계 뉴런을 보호 하기 위해 제안 되었습니다. 이 중요성 때문에, 이 연구원은 외부 유도제의 존재에 있는 성상세포에 있는 산화 스트레스를 검출하는 분석증을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 그(것)들은 반응성 산소 종 검출을 위한 과산화수소 및 형광 탐사를 가진 성상 세포에 배양하여 이것을 했습니다. 후속 형광발생은 유동 세포계를 이용하여 분석하였다. 산화 스트레스를 위해 활성화된 성상세포는 형광 강도가 증가하는 부위 내에 속하는 것으로 관찰되었으며, 오른쪽으로 이동한 것으로 나타났다.

당신은 반응성 산소 종 또는 ROS를 검출에 JoVE의 비디오를 보았다. 요약하자면, 이 비디오에서 우리는 반응성 산소 종, 세포 대사 및 질병 사이의 연관성에 대해 논의했습니다. 그런 다음 반응성 산소 종 검출을 위한 분석의 원리와 절차를 검토했습니다. 마지막으로, 우리는 연구원이 그들의 조사에 이 방법을 적용하는 방법을 탐구했습니다. 반응성 산소 종의 여전히 수수께끼 같은 역할의 분석은 세포 생물학자에게 큰 관심을 가지고 있으며 형광 프로브를 이용한 신뢰할 수 있는 측정은 매우 귀중한 것으로 입증됩니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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