JoVE Science Education
Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Science Education Biochemistry
Density Gradient Ultracentrifugation
  • 00:00Overview
  • 00:40Principles of Density Gradient Ultracentrifugation
  • 02:47Preparing a Sucrose Density Gradient
  • 04:51Centrifugation
  • 05:55Applications
  • 08:15Summary

밀도 그라데이션 초원심분리

English

Share

Overview

밀도 그라데이션 극심분리는 생체 분자및 세포 구조를 분리하고 정화하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. 이 기술은 서스펜션에서 용매보다 밀도가 높은 입자가 퇴적물일 것이고, 밀도가 떨어지는 입자가 떠다니는 다는 사실을 악용합니다. 고속 초원심분리기는 원심분리관에서 밀도감소의 액체를 겹쳐서 확립할 수 있는 밀도 그라데이션 내에서 생체분자를 분리하기 위해 이 과정을 가속화하는 데 사용된다.

이 비디오는 샘플 준비, 자당 그라데이션 생성, 초원심 분리 및 분획된 별문 컬렉션을 보여주는 절차를 포함하여 밀도 그라데이션 초원심 분리의 원리를 다룹니다. 응용 분야는 다중 단백질 복합체의 분리, 핵산 복합체의 분리, 세슘 염화물 밀도 그라데이션을 사용하여 분리에 대해 설명합니다.

밀도 그라데이션 초원심분리는 생화학 실험을 위해 세포 구조를 분리하고 정화하는 일반적인 접근법입니다. 이 기술은 밀도 그라데이션에서 비파괴적으로 분리되는 세포 구성 요소를 위해 고속 또는 초원심분리기를 사용합니다. 이 비디오는 밀도 그라데이션 초원심분리의 원리를 설명하고, 자당 그라데이션을 사용하여 일반적인 절차를 제공하고, 일부 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

먼저 초원심분리기와 밀도 그라데이션의 원리를 살펴보겠습니다. 현탁액에는 액체 용매의 입자가 포함되어 있습니다. 중력 때문에, 입자는 용매 퇴적물보다 밀도가 높지만 용매 부유물보다 밀도가 낮습니다. 입자와 용매 사이의 밀도 차이가 클수록 분리가 빨라집니다.

초원심분리기는 고도로 제어된 속도로 회전하는 로터라는 유닛이 포함되어 있어 강한 중력장을 시뮬레이션합니다. 이 분야 내에서 입자와 용매 간의 밀도 차이가 확대됩니다.

필드의 강도는 회전 속도에 따라 달라집니다. 비교적 낮은 회전 속도로 작은 로터조차도 지구의 중력장보다 수천 배 더 강한 힘을 만들 수 있습니다.

튜브에 다른 밀도의 여러 액체가 포함되어 있는 경우 원심 분리는 밀도 순으로 별도의 층으로 유지되며, 가장 조밀한 액체가 베이스에 가장 가깝습니다. 여러 액체의 이러한 계층화는 “밀도 그라데이션”이라고합니다. 두 가지 유형이 있습니다. 단계 그라데이션에서 밀도를 줄이는 액체는 조심스럽게 위에 겹쳐져 있습니다. 연속 그라데이션에서 액체는 다양한 비율로 혼합되므로 밀도가 베이스 위쪽에서 원활하게 감소합니다.

셀룰러 세포기관은 “이소피닉 밀도-그라데이션 원심 분리”를 통해 단계 그라데이션을 사용하여 분리될 수 있습니다. 이것은 가장 간단하고 가장 일반적인 원심 분리 절차입니다.

이 절차는 세포 구조를 분리하는 데 사용됩니다. 세포기관이 조밀할수록 상단에 미토콘드리아가 있고 핵산이 바닥을 향해 더 많이 내려갑니다.

이제 기술의 원리를 알고 있으므로 실험실에서 살펴보겠습니다.

절차가 시작되기 전에 제조업체의 속도와 밀도 등급을 주목해야 하며 초원심분리기는 부식을 검사했습니다. 이 절차는 스윙 버킷 로터를 사용합니다.

첫째, 세포 물질은 세포세포를 균질화하여 제조되며, 이는 비파괴적으로 세포기관을 방출한다. 균동형은 저밀도 성분을 제거하기 위해 예비 저속 원심분리를 통해 분획될 수 있다. 다음으로, 자당 솔루션이 준비됩니다.

자크로즈는 양을 늘려 서 각 솔루션이 이전 보다 더 집중되고 따라서 밀도가 높아지므로 더 조밀합니다. 솔루션의 정확한 밀도는 유기체마다 다른 분리되는 구성 요소에 따라 달라집니다. 솔루션은 분리할 구성 요소 들 간의 밀도가 있어야 하며, 마지막 솔루션은 분석물의 밀도가 높은 구성 요소보다 밀도가 높습니다. 핵산과 같은 자당보다 조밀한 성분을 분리하기 위한 기술은 응용 분야에서 설명된다.

자당 그라데이션은 이제 깨끗한 원심분리기 튜브로 만들어집니다. 파이펫은 가장 농축된 자당 용액을 그리는 데 사용됩니다. 튜브가 똑바로 세워져 서 파이펫 팁은 벽에 높게 배치되고 액체가 꾸준히 아래로 분배됩니다. 작업 영역은 진동 및 기타 장애에서 벗어나는 것이 중요합니다.

팁을 교체한 후 밀도를 줄이는 순서대로 나머지 솔루션이 추가됩니다. 그들은 뚜렷한 층을 형성하고 혼합을 피하기 위해 신중하게 분배됩니다. 마지막으로, 세포 샘플의 약 반 밀리리터가 그라데이션 위에 첨가되고 튜브의 무게가 커집니다. 이것은 프로세스의 다음 단계인 중량 분포의 균형을 맞추는 데 사용됩니다.

원심 분리는 가능한 한 빨리 시작되어야 합니다. 튜브는 로터에 배치되며, 반대 슬롯에 동일한 무게의 빈 솔루션을 배치하여 균형을 잡습니다. 로터는 초원심분리기및 시스템 밀봉에 배치됩니다. 온도와 회전 속도와 시간이 설정됩니다. 일반적인 값은 16h에 대해 100,000 x g 이상의 힘으로 4 °C입니다.

원심 분리 후 튜브는 로터에서 철수하여 똑바로 세워지고 방해받지 않도록 주의합니다. 다른 셀룰러 구성 요소는 솔루션 계층 사이의 개별 대역으로 분획되었습니다. 분수는 주사기로 수집할 수 있습니다. 또는 튜브의 바닥은 미세한 살균 된 바늘과 멸균 튜브에서 수집 된 유출로 구멍을 뚫을 수 있습니다. 셀룰러 구성 요소가 이제 격리되었습니다. 그들은 -80 °C에서 저장할 수 있습니다.

이제 기본 절차를 살펴보셨으니 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

일반적인 응용 프로그램은 식물 세포에서 다중 단백질 복합체의 분리입니다. 이 예에서, 순환 전자 흐름을 담당하는 복합체는 광합성에서 광반응의 현장인 틸라코이드로부터 분리되고 있다. 이 절차는 14~45%의 자당 솔루션을 사용합니다. 원심분리는 4°C에서 14시간 동안 100,000xg 이상 발생합니다.

핵산은 자당보다 밀도가 높기 때문에 이소피닉 원심분리는 비파괴적으로 세포기관과 분리할 수 없습니다.

“속도-구역 원심분리”라고 하는 다른 기술이 사용됩니다. 그것은 그들의 퇴적속도에 따라 세포기관을 분리, 이는 그들의 밀도에 의존, 뿐만 아니라 그들의 적합성에 의존. 연속 그라데이션은 이 속성을 기반으로 구성 요소를 분리하는 데 사용됩니다.

절차 단계는 이소피닉 케이스를 위한 것과 유사합니다. 이 예에서 RNA-리보솜 복합체는 5%에서 20%의 연속 그라데이션을 사용하여 격리되고, 원심분리는 230,000 x g로 분리된다. 원심분리는 강수량을 방지하기 위해 몇 시간 후에 중단됩니다.

핵산 가닥은 밀도에 기초하여 서로 분리될 수 있다.

구아닌과 사이토신이 풍부한 가닥은 아데닌과 티아민이 풍부한 가닥보다 밀도가 높기 때문입니다. 이 경우, 자당이 핵산보다 밀도가 낮기 때문에 그라데이션은 자당으로 만들 수 없습니다. 대신, 염화물 그라데이션세슘은 일반적으로 1.65에서 1.75 g/mL까지 충분한 밀도와 낮은 점도를 가지고 있기 때문에 사용됩니다.

여기서 우리는 플랑크톤 DNA가 연속적인 염화염화물 그라데이션을 사용하여 정제되는 것을 봅습니다. 원심분리는 진공 상태에서 18h의 경우 1,000,000 x g 이상으로 발생합니다.

자당 밀도 그라데이션으로 초원심 분리에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이제 밀도 그라데이션의 작동 방식, 단계 그라데이션 을 구성하는 방법, 초원심분리기를 로드하고 작동하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

Procedure

밀도 그라데이션 극심분리는 생체 분자및 세포 구조를 분리하고 정화하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. 이 기술은 서스펜션에서 용매보다 밀도가 높은 입자가 퇴적물일 것이고, 밀도가 떨어지는 입자가 떠다니는 다는 사실을 악용합니다. 고속 초원심분리기는 원심분리관에서 밀도감소의 액체를 겹쳐서 확립할 수 있는 밀도 그라데이션 내에서 생체분자를 분리하기 위해 이 과정을 가속화하는 데 사용된다….

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Transcript

Density gradient ultracentrifugation is a common approach to isolate and purify cell structures for biochemical experiments. The technique uses a high-speed, or ultra, centrifuge to nondestructively separate cellular components in a density gradient. This video describes the principles of density gradient ultracentrifugation, provides a general procedure using a sucrose gradient, and discusses some applications.

Let’s start by examining the principles of ultracentrifuges and density gradients. A suspension contains particles in a liquid solvent. Because of gravity, particles denser than the solvent sediment out while those less dense than the solvent float. The greater the difference in density between the particle and the solvent, the faster the separation.

An ultracentrifuge contains a unit called a rotor, which rotates at highly controlled speeds, simulating a strong gravitational field. Within this field, the differences in density between particles and the solvent are magnified.

The strength of the field depends on the speed of rotation. Even a small rotor at a relatively low rotational speed can create a force thousands of times stronger than the earth’s gravitational field.

If a tube contains several liquids of different densities, centrifugation will keep them in separate layers in order of density, with the densest liquid closest to the base. Such a layering of multiple liquids is called a “density gradient.” There are two types. In step gradients, liquids of decreasing density are carefully layered on top one another. In continuous gradients, the liquids are mixed in varying proportions, so the density decreases smoothly from the base upwards.

Cellular organelles can be separated using a step gradient, through “isopycnic density-gradient centrifugation.” This is the simplest and most common centrifugation procedure.

This procedure is used to separate the cellular structures. The more dense the organelle, the further it descends-with mitochondria at the top and nucleic acids towards the bottom.

Now that you know the principles behind the technique, let’s see it in the lab.

Before the procedure is started, the manufacturer’s speed and density ratings should be noted, and the ultracentrifuge checked for corrosion. This procedure uses a swinging-bucket rotor.

First, the cellular material is prepared by homogenizing the cells, which nondestructively releases their organelles. The homogenate may be fractionated through preliminary low-speed centrifugation, to remove low-density components. Next, the sucrose solutions are prepared.

Sucrose is added in increasing amounts so each solution is more concentrated, and therefore denser, than the preceding one. The exact densities of the solutions will depend on the components to be separated, which vary between organisms. The solutions should have densities between those of the components to be separated, with the last solution denser than the densest component of the analyte. Techniques for separating components denser than sucrose, like nucleic acids, are described in the applications.

The sucrose gradient is now created in a clean centrifuge tube. A pipette is used to draw up the most concentrated sucrose solution. With the tube held upright, the pipette tip is placed high against the wall, and the liquid dispensed steadily down. It’s important that the working area is kept free of vibrations and other disturbances.

After replacing the tip, the remaining solutions are added in order of decreasing density. They are dispensed carefully to form distinct layers and avoid mixing. Finally, about half a milliliter of the cellular sample is added atop the gradient, and the tube is weighed. This is used to balance the weight distribution, the next step of the process.

Centrifugation should begin as soon as possible. The tube is placed in the rotor, which is then balanced by placing blank solutions of equal weight in opposing slots. The rotor is placed in the ultracentrifuge and the system sealed. The temperature and rotation speed and time are set. Typical values are 4 °C with a force of over 100,000 x g for 16 h.

After centrifugation, the tube is withdrawn from the rotor, taking care to keep it upright and undisturbed. The different cellular components have fractionated into discrete bands between the solution layers. The fractions can be collected with a syringe. Alternately, the bottom of the tube can be punctured with a fine, sterilized needle and the outflow collected in sterile tubes. The cellular components have now been isolated. They can be stored at -80 °C.

Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.

A typical application is the isolation of multi-protein complexes in plant cells. In this example, complexes responsible for cyclic electron flow are being isolated from the thylakoid, the site of the light reaction in photosynthesis. This procedure uses discrete solutions of 14 to 45% sucrose. Centrifugation occurs over 100,000 x g for 14 h at 4 °C.

Because nucleic acids are denser than sucrose, isopycnic centrifugation cannot separate them from organelles nondestructively.

A different technique, known as “rate-zonal centrifugation” is used. It separates organelles based on their sedimentation rates, which depend not only on their densities, but also on their conformations. A continuous gradient is used to separate the components based on this property.

The procedural steps are similar to those for isopycnic cases. In this example, RNA-ribosome complexes are isolated using a continuous gradient of 5% to 20%, centrifuged at 230,000 x g. Centrifugation is interrupted after a few hours to prevent co-precipitation.

Nucleic acid strands can be separated from each other on the basis of density.

This is because strands rich in guanine and cytosine are denser than those rich in adenine and thiamine. In this case, the gradient cannot be made of sucrose, because sucrose is less dense than nucleic acids. Instead, cesium chloride gradients, typically from 1.65 to 1.75 g/mL are used, as they have sufficient density and a low viscosity.

Here we see plankton DNA being purified using a continuous cesium chloride gradient. Centrifugation occurs at over 1,000,000 x g for 18 h under vacuum.

You’ve just watched JoVE’s video on ultracentrifugation with a sucrose density gradient. You should now understand how a density gradient works, how to construct a step gradient, and how to load and operate an ultracentrifuge. Thanks for watching!

Tags

Cite This
JoVE Science Education Database. JoVE Science Education. Density Gradient Ultracentrifugation. JoVE, Cambridge, MA, (2023).

Related Videos