MALDI-TOF-Massenspektrometrie
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Overview
Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) ist eine Massenspektrometrie Ionenquelle ideal für die Analyse von Biomolekülen. Anstelle von ionisierenden Verbindungen in den gasförmigen Zustand, sind Proben eingebettet in eine Matrix, die durch einen Laser getroffen wird. Die Matrix nimmt den Großteil der Energie; ein Teil dieser Energie wird dann übertragen auf die Probe, die infolgedessen ionisiert. Probe-Ionen können dann mit einem Time-of-Flight Analyzer (TOF) identifiziert werden.
Dieses Video umfasst Grundsätze der MALDI-TOF, einschließlich Matrix Auswahl und Verwendung TOF zum Masse-Ladungs-Verhältnis zu erhellen. Dieses Verfahren zeigt die Vorbereitung einer MALDI-Platte, die Beladung der Proben auf den Teller und den Betrieb von der TOF Massenspektrometer. Im letzten Abschnitt sind Anwendungen und Variationen, einschließlich der gesamten Zellanalyse, Charakterisierung von komplexen biologischen Proben und Elektron-Spray-Ionisation gezeigt.
Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation ist MALDI, eine Massenspektrometrie Ionenquelle ideal für die Analyse von Biomolekülen. Die meisten Ionenquellen entfernen strukturelle Informationen aus großen, empfindlichen Biomoleküle. MALDI unterhält Strukturintegrität und daher Informationen, während die Moleküle in der Masse Analysator, trennt die Verbindungen, die je nach Größe und Ladung zu beschleunigen. Die am häufigsten gekoppelten mit MALDI ist die Zeit des Fluges oder TOF, Masse Analysator. Dieses Video zeigt die Konzepte der MALDI Ionisation, ein allgemeines Verfahren, und einige ihrer Anwendungen in der Biochemie.
Für die Massenspektrometrie, Funktion müssen Moleküle in den gasförmigen Zustand ionisiert werden. In MALDI ist die Probe eingebettet in eine Matrix, in der Regel eine organische Verbindung enthaltenden aromatisch und konjugierten Doppelbindungen.
Wenn ein Laserpuls trifft diese Mischung, die Matrix absorbiert, der Großteil der Energie schnell erwärmt, und desorbiert oder veröffentlicht, von der Oberfläche. Energetisierte Matrix übernimmt einen Teil seiner Energie in Biomoleküle, plötzliches und dann ionisiert sie.
MALDI paart sich in der Regel mit einer Zeit von Flug- oder TOF, Masse Analysator. Ein elektrisches Feld gilt kinetische Energie der Ionen zu einem feldfreien Region ein Drift-Rohr genannt. Die Geschwindigkeit der Ionen wie sie durch das Rohr bewegen ihre Masse-Ladungs-Verhältnis bezieht sich auf so schwerere Teilchen langsamer durch Instrument Reisen. Ein Detektor am Ende des Rohres misst jedes Ion Flugzeit. Mit diesem Wissen sowie die Rohrlänge und angewandte Feldstärke kann die Masse-Ladungs-Verhältnis jedes Ion aufgeklärt werden.
Dieses Grundstück der Signalintensität, Masse-zu-Ladung-Verhältnis, bekannt als ein Massenspektrum, kann zu einer Bibliothek von gesammelten Spektren verglichen werden. Wenn keine Übereinstimmungen gefunden werden, es können Moleküle durch weitere Techniken, wie Tandem-Massenspektrometrie identifiziert werden können. Weitere Informationen finden Sie in dieser Sammlung Video zum Thema.
Nun, die Grundlagen der MALDI-TOF diskutiert haben, schauen Sie sich bitte an den Prozess im Labor.
Bevor Sie ein Experiment beginnen, ist es wichtig, die Wahl der Matrix zu betrachten, von denen Proben desorbiert werden. Es muss die Laserenergie absorbieren, in einem Vakuum stabil sein, nicht reagieren mit der Zielmoleküle und können zu desorbieren. Abhängig von der Probe werden verschiedene Matrizen bevorzugt. Für ein großes Protein hat eine Kombination aus CHCA und DHB besseren Trennung der Zinnen, sogenannte Auflösung, als die einzelnen Matrizen gezeigt.
Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, um Proben vorzubereiten. Wir zeigen, was als “Double-Layer” oder “Sandwich”, Methode bekannt ist. Um zu beginnen, reinigen Sie den MALDI-Teller mit hochreine Reagenzien, wie Massenspektrometrie sehr empfindlich gegenüber Verunreinigungen ist. Trocknen Sie die Platte mit einem Strom von Inertgas.
Als nächstes eine gesättigte Matrixlösung erfolgt in der Regel mit einem organischen Lösungsmittel. Die Lösung ist auf die MALDI-Platte gestreift und getrocknet. Eine zweite gesättigte Lösung der Matrix mit Trifluoroacetic Säure oder TFA, wird vorbereitet. TFA hilft Ionen in der Gasphase.
Als nächstes wird die Beispiellösung auf der getrockneten Matrix Stelle hinzugefügt. Fügen Sie die Matrixlösung mit TFA auf die Probe, damit Abschluss der Matrix “Sandwich”. Homogenität des Spots kann unter dem Niedrigstrom-Mikroskop überprüft werden.
Platte einen Kalibrierung Standard, das ist eine Mischung mit einer breiten Palette von bekannten Massen und wird verwendet, um die Flugzeit bis m/Z korrelieren. Zu guter Letzt Platte der Matrix allein als Negativkontrolle.
Um die Flecken zu analysieren, legen Sie die Zieltafel in das Instrument. Sicherzustellen Sie, dass kein Schmutz vorhanden ist, so dass für die Bildung eines engen Vakuums. Wählen Sie in der Software die Norm, negative Kontrolle und Proben von Interesse. Beschriften Sie die Stellen mit den korrekte Identifizierung.
Die Ionen-Quelle und Objektiv Spannungen können manipuliert werden, zur Verbesserung der Leistung der Analyse. Dies hängt von den Besonderheiten des Instrumentes und Probe. Im Fokus der standard Spot und kalibrieren Sie das Gerät mit der Software.
Als nächstes sammeln Sie Spektren aus jeder der die Probe stellen. Versuchen Sie ein paar verschiedene Standorten vor Ort, um die Qualität der erhobenen Daten zu maximieren. Sobald beendet, kann nach der Reinigung die MALDI-Platte gesammelt und wiederverwendet werden.
Nun, da wir ein Verfahren überprüft haben, betrachten wir einige der Möglichkeiten, wie, die MALDI genutzt wird, und eine unterschiedliche Ionisation Technik.
Neben Biomoleküle kann MALDI verwendet werden, um lebende Zellen zu analysieren. Makrophagen sind Immunzellen, die auf einer der verschiedenen Formen, basierend auf ihrer Mikroumgebung nehmen. Nach Freilegung der Zellen zu verschiedenen Signalisierung Moleküle oder Zytokine, können sie direkt auf die Platte hinzugefügt werden, und analysiert. Die MALDI-Spektren können als einzigartige “Fingerabdrücke”, abhängig von der Cytokine verwendet verwendet werden.
Komplexe biologische Proben wie Säugetier-sebaceous Absonderungen einen Schritt der Reinigung vor der MALDI Analyse erfordern. Dünnschichtchromatographie ist eine solche Technik, die auf die Komponenten Polarität beruht. Die Verbindungen sind aus der TLC-Pastete gesammelt, gereinigt und auf eine MALDI-Matrix übertragen. Die daraus resultierende Spektren überprüfen die Identität und Reinheit der getrennten Biomoleküle von Säugetieren sebaceous Absonderungen.
Eine weitere häufige Ionen-Quelle für Biomoleküle ist Elektrospray-Ionisation oder ESI. Bei dieser Methode wird die Probe in das Instrument, wo eine hohe Spannung angelegt ist, injiziert ein Aerosol aus geladenen Tröpfchen zu schaffen. Als Lösungsmittel in der Tropfen verdunstet, wird die Ladung in die Probe Moleküle, verschoben, bis sie vollständig gasförmig sind. ESI das spotting Verfahren erfordert keine, und die Probe kann direkt in das Instrument injiziert werden. Auf der anderen Seite ist ESI empfindlicher auf das Vorhandensein von Puffer-Komponenten und anderen Verunreinigungen, was bedeutet, dass MALDI robuster ist.
Sie haben nur Jupiters Video auf MALDI Massenspektrometrie angesehen. Dieses Video beschrieben die Theorie hinter dem Instrument, ging über ein allgemeines Verfahren und einige der Anwendungen von der Technik abgedeckt. Danke fürs Zuschauen!
Procedure
Disclosures
Transcript
Matrix-assisted laser desorption ionization, or MALDI, is a mass spectrometry ion source ideal for the analysis of biomolecules. Most ion sources remove structural information from large, fragile biomolecules. MALDI maintains structural integrity, and therefore information, while accelerating the molecules into the mass analyzer, which separates the compounds based on size and charge. The most commonly coupled with MALDI is the time of flight, or TOF, mass analyzer. This video will show the concepts of MALDI ionization, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
For mass spectrometry to function, molecules must be ionized into the gaseous state. In MALDI, the sample is embedded in a matrix, typically an organic compound containing aromatic and conjugated double bonds.
When a laser pulse strikes this mixture the matrix absorbs the majority of the energy, rapidly heats, and is desorbed, or released, from the surface. The energized matrix transfers some of its energy to the biomolecules, desorbing and then ionizing them.
MALDI is typically paired with a time of flight, or TOF, mass analyzer. An electric field applies kinetic energy to the ions, moving them into a field-free region called a drift tube. The velocity of the ions as they move through the tube is related to their mass-to-charge ratio, so heavier particles travel slower through instrument. A detector at the end of the tube measures each ion’s flight time. With this knowledge, as well as the tube length and applied field strength, the mass-to-charge ratio of each ion can be elucidated.
This plot of signal intensity to mass-to-charge-ratio, known as a mass spectrum, can be compared to a library of collected spectra. If no matches are found, it can molecules can be identified by further techniques, such as tandem mass spectrometry. For more information, see this collection’s video on the topic.
Now that the basics of MALDI-TOF have been discussed, let’s look at the process in the laboratory.
Before beginning an experiment, it’s important to consider the choice of matrix from which samples will be desorbed. It must absorb the laser energy, be stable in a vacuum, not react with the target molecules, and be able to desorb. Depending on the sample, different matrices are preferred. For a large protein, a combination of CHCA and DHB has shown better separation of the peaks, called resolution, than the individual matrices.
There are a number of ways to prepare samples. We’ll show what is known as the “double-layer”, or “sandwich,” method. To begin, clean the MALDI plate with ultra-pure reagents, as mass spectrometry is very sensitive to contamination. Dry the plate with a stream of inert gas.
Next, a saturated matrix solution is made, typically with an organic solvent . The solution is streaked onto the MALDI plate and dried. A second saturated solution of matrix containing trifluoroacetic acid, or TFA, is prepared. TFA helps ions into the gaseous phase.
Next, the sample solution is added on top of the dried matrix spot. Add the matrix solution containing TFA on top of the sample, thereby completing the matrix “sandwich”. Homogeneity of the spot can be verified under a low-powered microscope.
Plate a calibration standard, which is a mixture with a wide range of known masses and is used to correlate the time-of-flight to m/z. Finally, plate the matrix alone as a negative control.
To analyze the spots, place the target plate into the instrument. Ensure there’s no debris present, allowing for the formation of a tight vacuum. In the software, select the standard, negative control, and samples of interest. Label the spots with the correct identification.
The ion source and lens voltages can be manipulated to improve performance of the analysis. This will depend on the specifics of the instrument and sample. Focus on the standard spot and calibrate the instrument with the software.
Next, collect spectra from each of the sample spots. Try a few different locations on the spot to maximize the quality of the collected data. Once finished, the MALDI plate can be collected and reused after cleaning.
Now that we’ve reviewed a procedure, let’s look at some of the ways MALDI is utilized, and a different ionization technique.
In addition to biomolecules, MALDI can be used to analyze living cells. Macrophages are immune cells that take on one of several different forms, based on their microenvironment. After exposing the cells to various signaling molecules, or cytokines, they can be added directly to the plate, and analyzed. The MALDI spectra can be used as unique “fingerprints”, depending on the cytokine used.
Complex biological samples like mammalian sebaceous secretions require a step of purification before MALDI analysis. Thin layer chromatography is one such technique that relies on the components’ polarity. The compounds are collected from the TLC pate, purified, and transferred to a MALDI matrix. The resulting spectra verify the identity and purity of the separated biomolecules from the mammalian sebaceous secretions.
Another common ion source for biomolecules is electrospray ionization, or ESI. In this method, the sample is injected into the instrument, where a high voltage is applied, creating an aerosol of charged droplets. As the solvent in the droplet evaporates, the charge is moved to the sample molecules, till they are completely gaseous. ESI doesn’t require the spotting procedure, and the sample can be injected directly into the instrument. On the other hand, ESI is more sensitive to the presence of buffer components and other contaminants, meaning MALDI is more robust.
You’ve just watched JoVE’s video on MALDI mass spectrometry. This video described the theory behind the instrument, went over a general procedure, and covered some of the uses of the technique. Thanks for watching!
