Overview
I saggi di co-immunoprecipitazione (CoIP) e pull-down sono metodi strettamente correlati per identificare interazioni proteine-proteine stabili. Questi metodi sono correlati all'immunoprecipitazione, un metodo per separare una proteina bersaglio legata a un anticorpo da proteine non legate. In CoIP, una proteina legata agli anticorpi è a sua volta legata a un'altra proteina che non si lega con l'anticorpo, questo è seguito da un processo di separazione che preserva il complesso proteina-proteina. La differenza nei saggi pull-down è che le proteine esca marcate con affinità sostituiscono gli anticorpi e la cromatografia di affinità viene utilizzata per isolare complessi proteina-proteina.
Questo video spiega il CoIP, i test pull-down e la loro implementazione in laboratorio. Viene trattato un protocollo passo-passo per ogni tecnica, inclusi i reagenti, gli apparecchi e gli strumenti utilizzati per purificare e analizzare le proteine legate. Inoltre, la sezione applicazioni di questo video descrive una procedura per studiare come le proteine del mixovirus inibiscono la nucleoproteina dell'influenza, un'indagine sul ruolo degli ioni calcio nella calmodulina tramite un test pull-down e un test pull-down modificato per caratterizzare le interazioni proteiche transitorie.
Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo significativo in un'ampia varietà di funzioni biologiche. La maggior parte delle interazioni proteina-proteina e i loro effetti biologici devono ancora essere identificati. La co-immunoprecipitazione, o CoIP, e i test pull-down sono due metodi strettamente correlati per l'identificazione di interazioni proteine-proteine stabili. Questo video coprirà i principi dei due saggi, le loro procedure di laboratorio generali e le applicazioni di queste tecniche.
CoIP e test pull-down sono varianti di immunoprecipitazione, un metodo per isolare selettivamente una specie proteica da una soluzione complessa. In un esperimento di immunoprecipitazione, un anticorpo specifico di una proteina bersaglio è autorizzato a formare un immuno complesso con quel bersaglio nel campione. Il complesso viene quindi catturato su un supporto solido, tipicamente la proteina A legata a una perla di sefarosio. Tutte le proteine non catturate vengono rimosse mediante fasi di centrifugazione. La proteina viene quindi rilasciata dall'anticorpo e dal supporto solido mediante ebollizione nella riduzione del buffer di carico del campione SDS-PAGE.
La co-immunoprecipitazione è condotta nello stesso modo, tranne per il fatto che i complessi proteici intatti vengono catturati sul supporto solido. L'anticorpo si lega alla proteina bersaglio, che a sua volta è legata a un'altra proteina che non è presa di mira dall'anticorpo. Come nell'immunoprecipitazione, il complesso proteico viene rilasciato dall'anticorpo e dal supporto solido mediante ebollizione nella riduzione del tampone di carico del campione SDS-PAGE.
I test di pull-down sono simili alla co-immunoprecipitazione, differendo solo nell'uso di una proteina "esca", al contrario di un anticorpo. Attraverso tecniche di biologia molecolare, questa proteina esca viene ingegnerizzata con un tag di affinità, come una serie di residui di istidina. Questi tag di affinità sono descritti in "Separazioni biomolecole basate sulla cromatografia". La proteina viene quindi catturata su un ligando di affinità immobilizzato specifico per il tag. La proteina catturata viene quindi incubata con un campione che contiene proteine che formano complessi con l'"esca". Il complesso proteico viene rilasciato dal supporto di affinità mediante lavaggio con una soluzione contenente un analita competitivo specifico per il tag sulla proteina "esca". I test pull-down sono utili per confermare le interazioni proteiche previste dalla co-immunoprecipitazione e per scoprire interazioni proteiche sconosciute.
Ora che i principi di co-immunoprecipitazione e i test di pull-down sono stati discussi, diamo un'occhiata alle loro procedure di laboratorio.
Per prima cosa discutiamo della co-immunoprecipitazione. A una serie di tubi di microfuga, si aggiunge quanto segue: tampone PBS e una soluzione al 50% di proteina A-sefarosio, un complesso resina-proteina che si lega all'anticorpo. I tubi del microfuga vengono ruotati per garantire una corretta distribuzione, quindi la resina viene lavata con un buffer PBS aggiuntivo. Il lisato cellulare, contenente la proteina desiderata, e 2 μg di anticorpo vengono aggiunti ai tubi del microfugo e la miscela viene ruotata per 1 ora a 4 °C. Le perle vengono pellettizzate mediante centrifugazione, il surnatante viene scartato e le perle rilavate tre volte con tampone per rimuovere le proteine non legate. Le pere contenenti il complesso anticorpo-proteina sono in riduzione del tampone di carico del campione SDS-PAGE, per la rimozione del complesso dall'anticorpo e per l'analisi mediante SDS-PAGE e immunoblotting.
Ora discuteremo la procedura per i saggi di pull-down: la proteina "esca" è espressa in un plasmide con il tag di affinità appropriato. Dopo aver raggiunto la crescita in fase logaritria, le cellule vengono lizzate e quindi centrifughe. Le perle di streptavitina-sefarosio sospese, che catturano la proteina "esca" etichettata con biotina, vengono pipettate in un tubo di microfuga. Le perle vengono quindi centrifugate e il surnatante accuratamente rimosso mediante aspirazione. Le perle vengono quindi lavate con tampone, centrifugate e il surnatante rimosso.
Le cellule contenenti la presunta proteina "preda", che ha un'affinità per la proteina "esca", vengono raccolte mediante centrifugazione. Il surnatante viene quindi aggiunto al tubo del microfugo contenente la resina e incubato a 4 °C per 3 ore su uno shaker. La resina viene quindi centrifugata, il surnatante rimosso e la resina lavata per rimuovere le proteine non legate. Il tampone di eluizione viene aggiunto alla resina e la miscela viene incubata a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker. La resina viene quindi centrifugata e il surnatante contenente il complesso desiderato viene analizzato mediante immunoblotting.
Ora che abbiamo esaminato le procedure, diamo un'occhiata ad alcune delle applicazioni utili della co-immunoprecipitazione e dei test di pull-down.
La coimmunoprecipitazione può essere utile per comprendere meglio il meccanismo d'azione degli enzimi. Le proteine di resistenza al mixovirus, o Mx-, inibiscono una vasta gamma di virus, tra cui l'influenza A, per i quali il meccanismo è poco compreso. La co-immunoprecipitazione è stata utilizzata per studiare l'interazione tra la proteina Mx1 del topo e la nucleoproteina dell'influenza.
I test pull-down si sono dimostrati utili nello studio degli effetti dei secondi messaggeri, che sono proteine che comunicano un segnale dall'ambiente cellulare. Sono un componente di una via di segnalazione in cui più proteine interagiscono in risposta a segnali ambientali. Gli ioni calcio agiscono come messaggeri secondari legandosi alla calmodulina, che a sua volta si lega a un'ampia varietà di proteine, mediando molti tipi di risposte biologiche. Senza il calcio, la proteina non può legarsi alla calmodulina. È stato condotto un test di pull-down per testare la capacità delle proteine di legarsi alla calmodulina in presenza o assenza di ioni calcio.
I saggi di co-immunoprecipitazione e pull-down sono generalmente utilizzati per analizzare le interazioni proteiche stabili o forti, ma non quelle transitorie. Un recente sviluppo nei saggi pull-down, l'HaloTag, ha semplificato lo studio delle interazioni proteiche transitorie; HaloTag è un tag di fusione proteica geneticamente codificato, fuso alla proteina di interesse, in grado di reagire chimicamente con un supporto solido aloalcano. Se si desidera un'analisi funzionale, il complesso proteico, meno il tag, nella sua interezza potrebbe quindi essere isolato incubando con proteasi del virus dell'incisione del tabacco.
Hai appena visto il video di JoVE sulla co-immunoprecipitazione e sui test di pull-down. Questo video descrive i principi dei due metodi, le procedure generali di laboratorio e alcune delle loro applicazioni.
Grazie per l'attenzione!
Procedure
I saggi di co-immunoprecipitazione (CoIP) e pull-down sono metodi strettamente correlati per identificare interazioni proteine-proteine stabili. Questi metodi sono correlati all'immunoprecipitazione, un metodo per separare una proteina bersaglio legata a un anticorpo da proteine non legate. In CoIP, una proteina legata agli anticorpi è a sua volta legata a un'altra proteina che non si lega con l'anticorpo, questo è seguito da un processo di separazione che preserva il complesso proteina-proteina. La differenza nei saggi pull-down è che le proteine esca marcate con affinità sostituiscono gli anticorpi e la cromatografia di affinità viene utilizzata per isolare complessi proteina-proteina.
Questo video spiega il CoIP, i test pull-down e la loro implementazione in laboratorio. Viene trattato un protocollo passo-passo per ogni tecnica, inclusi i reagenti, gli apparecchi e gli strumenti utilizzati per purificare e analizzare le proteine legate. Inoltre, la sezione applicazioni di questo video descrive una procedura per studiare come le proteine del mixovirus inibiscono la nucleoproteina dell'influenza, un'indagine sul ruolo degli ioni calcio nella calmodulina tramite un test pull-down e un test pull-down modificato per caratterizzare le interazioni proteiche transitorie.
Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo significativo in un'ampia varietà di funzioni biologiche. La maggior parte delle interazioni proteina-proteina e i loro effetti biologici devono ancora essere identificati. La co-immunoprecipitazione, o CoIP, e i test pull-down sono due metodi strettamente correlati per l'identificazione di interazioni proteine-proteine stabili. Questo video coprirà i principi dei due saggi, le loro procedure di laboratorio generali e le applicazioni di queste tecniche.
CoIP e test pull-down sono varianti di immunoprecipitazione, un metodo per isolare selettivamente una specie proteica da una soluzione complessa. In un esperimento di immunoprecipitazione, un anticorpo specifico di una proteina bersaglio è autorizzato a formare un immuno complesso con quel bersaglio nel campione. Il complesso viene quindi catturato su un supporto solido, tipicamente la proteina A legata a una perla di sefarosio. Tutte le proteine non catturate vengono rimosse mediante fasi di centrifugazione. La proteina viene quindi rilasciata dall'anticorpo e dal supporto solido mediante ebollizione nella riduzione del buffer di carico del campione SDS-PAGE.
La co-immunoprecipitazione è condotta nello stesso modo, tranne per il fatto che i complessi proteici intatti vengono catturati sul supporto solido. L'anticorpo si lega alla proteina bersaglio, che a sua volta è legata a un'altra proteina che non è presa di mira dall'anticorpo. Come nell'immunoprecipitazione, il complesso proteico viene rilasciato dall'anticorpo e dal supporto solido mediante ebollizione nella riduzione del tampone di carico del campione SDS-PAGE.
I test di pull-down sono simili alla co-immunoprecipitazione, differendo solo nell'uso di una proteina "esca", al contrario di un anticorpo. Attraverso tecniche di biologia molecolare, questa proteina esca viene ingegnerizzata con un tag di affinità, come una serie di residui di istidina. Questi tag di affinità sono descritti in "Separazioni biomolecole basate sulla cromatografia". La proteina viene quindi catturata su un ligando di affinità immobilizzato specifico per il tag. La proteina catturata viene quindi incubata con un campione che contiene proteine che formano complessi con l'"esca". Il complesso proteico viene rilasciato dal supporto di affinità mediante lavaggio con una soluzione contenente un analita competitivo specifico per il tag sulla proteina "esca". I test pull-down sono utili per confermare le interazioni proteiche previste dalla co-immunoprecipitazione e per scoprire interazioni proteiche sconosciute.
Ora che i principi di co-immunoprecipitazione e i test di pull-down sono stati discussi, diamo un'occhiata alle loro procedure di laboratorio.
Per prima cosa discutiamo della co-immunoprecipitazione. A una serie di tubi di microfuga, si aggiunge quanto segue: tampone PBS e una soluzione al 50% di proteina A-sefarosio, un complesso resina-proteina che si lega all'anticorpo. I tubi del microfuga vengono ruotati per garantire una corretta distribuzione, quindi la resina viene lavata con un buffer PBS aggiuntivo. Il lisato cellulare, contenente la proteina desiderata, e 2 μg di anticorpo vengono aggiunti ai tubi del microfugo e la miscela viene ruotata per 1 ora a 4 °C. Le perle vengono pellettizzate mediante centrifugazione, il surnatante viene scartato e le perle rilavate tre volte con tampone per rimuovere le proteine non legate. Le pere contenenti il complesso anticorpo-proteina sono in riduzione del tampone di carico del campione SDS-PAGE, per la rimozione del complesso dall'anticorpo e per l'analisi mediante SDS-PAGE e immunoblotting.
Ora discuteremo la procedura per i saggi di pull-down: la proteina "esca" è espressa in un plasmide con il tag di affinità appropriato. Dopo aver raggiunto la crescita in fase logaritria, le cellule vengono lizzate e quindi centrifughe. Le perle di streptavitina-sefarosio sospese, che catturano la proteina "esca" etichettata con biotina, vengono pipettate in un tubo di microfuga. Le perle vengono quindi centrifugate e il surnatante accuratamente rimosso mediante aspirazione. Le perle vengono quindi lavate con tampone, centrifugate e il surnatante rimosso.
Le cellule contenenti la presunta proteina "preda", che ha un'affinità per la proteina "esca", vengono raccolte mediante centrifugazione. Il surnatante viene quindi aggiunto al tubo del microfugo contenente la resina e incubato a 4 °C per 3 ore su uno shaker. La resina viene quindi centrifugata, il surnatante rimosso e la resina lavata per rimuovere le proteine non legate. Il tampone di eluizione viene aggiunto alla resina e la miscela viene incubata a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker. La resina viene quindi centrifugata e il surnatante contenente il complesso desiderato viene analizzato mediante immunoblotting.
Ora che abbiamo esaminato le procedure, diamo un'occhiata ad alcune delle applicazioni utili della co-immunoprecipitazione e dei test di pull-down.
La coimmunoprecipitazione può essere utile per comprendere meglio il meccanismo d'azione degli enzimi. Le proteine di resistenza al mixovirus, o Mx-, inibiscono una vasta gamma di virus, tra cui l'influenza A, per i quali il meccanismo è poco compreso. La co-immunoprecipitazione è stata utilizzata per studiare l'interazione tra la proteina Mx1 del topo e la nucleoproteina dell'influenza.
I test pull-down si sono dimostrati utili nello studio degli effetti dei secondi messaggeri, che sono proteine che comunicano un segnale dall'ambiente cellulare. Sono un componente di una via di segnalazione in cui più proteine interagiscono in risposta a segnali ambientali. Gli ioni calcio agiscono come messaggeri secondari legandosi alla calmodulina, che a sua volta si lega a un'ampia varietà di proteine, mediando molti tipi di risposte biologiche. Senza il calcio, la proteina non può legarsi alla calmodulina. È stato condotto un test di pull-down per testare la capacità delle proteine di legarsi alla calmodulina in presenza o assenza di ioni calcio.
I saggi di co-immunoprecipitazione e pull-down sono generalmente utilizzati per analizzare le interazioni proteiche stabili o forti, ma non quelle transitorie. Un recente sviluppo nei saggi pull-down, l'HaloTag, ha semplificato lo studio delle interazioni proteiche transitorie; HaloTag è un tag di fusione proteica geneticamente codificato, fuso alla proteina di interesse, in grado di reagire chimicamente con un supporto solido aloalcano. Se si desidera un'analisi funzionale, il complesso proteico, meno il tag, nella sua interezza potrebbe quindi essere isolato incubando con proteasi del virus dell'incisione del tabacco.
Hai appena visto il video di JoVE sulla co-immunoprecipitazione e sui test di pull-down. Questo video descrive i principi dei due metodi, le procedure generali di laboratorio e alcune delle loro applicazioni.
Grazie per l'attenzione!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
