Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Protokoll för testning av romanen insektsbekämpning kemier mygg toxicitet
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Protokoll finns beskrivna för att bedöma toxiciteten av kemiska sammansättningar omogna och vuxna mygg för utveckling som nya klasser av larvicides, adulticides och endektocider. Protokollen aktivera hög genomströmning tester av flera kemiska sammansättningar på enpunkts-dos och efterföljande utvärdering via dos svar assay att bestämma toxicitet vid kontakt eller via förtäring.
Transcript
Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor i fälten för insekticidupptäckt och vektorkontroll. Som, hur giftigt är en oisolerad kemi till en population av mygglarver eller vuxna? Har kemin potential för utveckling som larvicid eller adulticide?
Och vad kan vara den mest effektiva leveransvägen? De viktigaste fördelarna med denna teknik är att den kan användas för att utvärdera toxiciteten av oformulerade kemister En kemis toxicitet mot flera arter av vektormyggor, och den kan skalas upp till evalute hundratals föreningar i hög genomloppskapacitet. Demonstrerar proceduren blir Jasleen Kaur, en vetenskaplig tekniker från mitt laboratorium.
Till att börja med märka brunnarna i en 24-brunns vävnadskulturplatta. Använd en analytisk balans för att väga testföreningen. Sedan, desolve föreningen i sterila dubbla destillerat vatten i en 1.5mL rör, vilket resulterar i en 80mM stamlösning.
Därefter seriebespänna stamlösningen med hjälp av dubbeldestillerat vatten för att förbereda fungerande stamlösningar av de önskade koncentrationerna. Observera att man måste vara försiktig med att larverna tillsätts till brunnarna, under avlägsnandet av överflödigt vatten, och när testkemin tillsätts för att undvika fysisk skada på larverna. Skada kan öka mortaliteten, och därmed ge falska positiva resultat eller ogiltigförklara analysen.
Använd en bred bar plastöverföringspipett för att överföra fem tredje instar larver till varje brunn av plattan. Använd sedan en en mL-pipett för att försiktigt ta bort vattnet, och ersätta det med önskad volym av dubbelt destillerat vatten. Var noga med att inte röra vid larverna när du tar bort vattnet arbeta snabbt för att säkerställa att larverna inte torkar, och tillsätt försiktigt testkemin genom att pipettera mot plastens motsatta sida.
Tillsätt en lämplig volym av testlösning till varje brunn, och rotera försiktigt plattan för att säkerställa enhetlig blandning. Placera plattan i en tillväxtkammare upprätthålla 12 timmars ljus / mörker cykel vid 25 grader celsius med 75 till 85 procent relativ luftfuktighet. För att kontrollera larvrörelse, knacka försiktigt på plattan.
Om ingen rörelse observeras, rör försiktigt larven med en steril tandpetare. Poäng larven som död om inget svar märks, och använd ett poängblad för att registrera det totala antalet döda larver i varje brunn, vid de tidpunkter som beskrivs i textprotokollet. Kultur tre till fem dagar gamla vuxna kvinnliga myggor i en 20 liters plastbur.
Etikett nio uns papper koppar med namn och koncentration av testning förening. Nästa, förbereda en 10mg/mL stamlösning av testföreningen i aceton i en 20mL glas injektionsflaska. Späd sedan seriellt stamlösningen för att erhålla de önskade arbetskoncentrationerna.
Rengör en mL-glasspruta med aceton. Fyll den sedan med testlösningen vid lämplig koncentration. Säkra sprutan i en mikro-applikator justerad för att leverera en volym på 0,25uL.
Därefter använder en aspirator för att ta bort 10, tre till fem dagar gamla vuxna kvinnliga myggor från buren. Söva dem i fem minuter vid fyra grader celsius. Överför sedan myggorna till en petriskål.
Placera skålen på is i 10 minuter. För att undvika att skada den vuxna myggan, vilket skulle kunna bidra till dödlighet, se till att de inte sövs i kylen i mer än fem minuter, eller immobiliserade på is i mer än 10, och minimera hanteringen av myggorna. Om du har tillgång till en kall tallrik, och en mikromanipulator med ett rörligt stadium, som ytterligare kan minimera hanteringen av myggorna.
Använd fin pincett för att ta bort varje mygga från skålen. Med sprutan mikro-applikator applicera 0.25uL av testlösning till dorsala bröstkorgen, under en dissekerande mikroskop Nästa, överföra myggorna till en märkt pappersmugg på is. Försegla koppen med en 10 av 10cm mesh kvadrat och ett gummiband Sedan överföra den till tillväxtkammaren, och registrera antalet döda myggor som tidigare beskrivits.
Samla in cirka 150 fyra till fem dagar gamla vuxna kvinnliga myggor med en aspirator, och överför dem till en separat bur. Avlägsna källan till socker en till 24 timmar före matningsanalysen. Bered en 80mM stamlösning av testföreningen i vatten.
Sedan, seriebespäd det med vatten, för att få fungerande lager lösningar av de önskade koncentrationerna. För att få önskade testkoncentrationer, tillsätt 40uL av varje spädning till 960uL av defibrinerat kaninblod i ett 1,5 mL-rör, och blanda genom pipettering. Placera ett medlemsfilter på en utfodringsenhet och försegla det med en gummiring.
Därefter använder en pipetter för att överföra en mL av blodet med testlösning genom leveransporten, som ligger på baksidan av utfodringsenheten. Fäst matningsenheten på en värmeenhet. Sedan, svabb membranet ytan försiktigt med nyberedda 10 procent mjölksyra lösning.
Placera utfodringsenheten i buren. Täck buren med en mörk trasa, och låt myggorna mata i en timme. Efter myggorna foder, placera buren i ett kylskåp vid fyra grader celsius i fem minuter för att bedöva myggorna.
Räkna sedan och registrera det totala antalet myggor i buren. Genom att undersöka buken, räkna och registrera det totala antalet helt och delvis utfodrats kvinnliga myggor. Minst 50 blodmatade myggor ska erhållas per dos.
Ta bort eventuella myggor som inte har matat. Därefter överför buren till en tillväxtkammare, och använd ett poängblad för att registrera antalet döda myggor vid lämpliga tidpunkter. På dag tre post-blod utfodring, placera en eggcup i buren i 72 timmar.
Använd ett dissekerande mikroskop för att räkna det totala antalet ägg som produceras per behandling. En larvkontaktanalys utfördes för att utvärdera effekten av amitriptylin, en dopaminreceptorantagonist, på larvdödlighet över tiden. Uppgifterna visade att LC 50-värdet minskar med tiden under experimentet.
Effekten av amitriptylin på dödlighet av vuxna kvinnliga myggor jämfördes med bifentrin, och två negativa kontroller. Jämfört med acetonbehandlade och obehandlade negativa kontroller, inducerade både amitriptylin och bifentrin betydande dödlighet vid varje experimentell tidpunkt. En kvantitativ utfodring assay utfördes för att utvärdera effekten av tre olika doser av amitriptylin på fecundity och procent dödlighet av vuxna kvinnliga myggor.
Uppgifterna visade ingen statistiskt signifikant skillnad i fecundity av amitriptylin matas myggor vid högsta dos jämfört med endast blodmatade kontroller. När behärskar, någon av de analyser vi har beskrivit här, kan slutföras i cirka två timmar av en enda individ, om korrekt utförs. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att försiktigt hantera organismen, och det bör finnas konsekvens under aktuella tillämpningar och under scoring larval eller vuxna assay.
Efter detta förfarande, andra metoder som bio-analyser för att utvärdera toxicitet via absorption, genom mygga tarsi, CDC flaskan analys, och WHO röret analys kan utföras för att svara på ytterligare frågor om effekten av den oformulerade kemi, eller en formulerad produkt, och potential för utveckling som en kontakt insektsmedel eller utrymme spray.
Tags
Biologi fråga 144 mygga Aedes aegypti Anopheles gambiae Culex quinquefasciatus larvicide adulticid endectocide bioassay toxicitet LC50Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
