Digitale PCR voor het kwantificeren van de circulerende MicroRNAs in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten
July 3rd, 2018
Circulerende microRNAs is gebleken belofte als biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen en acuut myocardiaal infarcten. In deze studie beschrijven we een protocol voor extractie van miRNA, omgekeerde transcriptie en digitale PCR voor de absolute kwantificering van miRNAs in het serum van patiënten met hart-en vaatziekten.
This method may help answer key questions in the diagnostic field, such as whether micro RNAs are valid biomarkers in cardiovascular disease. Compared to quantitative real-time PCR, digital PCR exhibits superior technical qualities for quantifying microRNAs in the circulation. As the sample is divided into about 20, 000 droplets, no duplicate measurements are necessary, and no standard curve is needed for quantification.
Although this method may provide insight into quantification of microRNAs in cardiovascular patients, it may also be applied to other patients and diseases, as other microRNAs have shown promise as biomarkers in cancer progression, it may also be applied to oncological patients. Generally, individuals new to this method will struggle because the generated droplets are fragile and need to be handled with care. After isolating RNA from serum samples, continue with reverse transcription to obtain more stable complementary DNA for dPCR.
To begin, thaw the reverse transcription kit on ice. Then spin the enzymes and the primers down. Next, prepare the master mix as described in the text protocol.
Combine 10 microliters of the master mix with five microliters of extracted RNA in each well of a 96-well plate. Then centrifuge the plate at 2, 000xg at four degrees Celsius for two minutes. Proceed with the reverse transcription as detailed in the text protocol.
First, thaw the commercial dPCR mix, cDNA and PCR primers on ice and centrifuge immediately before use. Then prepare the master mix as described in the text protocol. Add 1.33 microliter volumes of reverse transcription product to 18.67 microliters volumes of the master mix and centrifuge briefly.
Using a pipet, transfer 20 microliters of the sample into each well of the medium row of an eight well cassette. Then pipet 70 microliters of droplet generation oil into the oil wells of the cassette. Next, place a gasket on top of the cassette and place it in the droplet generator.
Close the droplet generator and wait until the three indicator lights are solid green. Using a pipet, carefully transfer 40 microliters of the droplet-formed sample into separate wells of a 96-well plate. Then seal the plate with dPCR foil at 180 degrees Celsius for four seconds.
Place the sealed PCR plate in the cycler and follow the cycling instructions outlined in the text protocol. Remove the plate from the thermocycler and transfer it to the base of a plate holder. Then place the top of the plate holder onto the PCR plate.
Finally, start the commercial dPCR software. In this protocol, digital PCR was used to quantify microRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease. Samples were taken from 16 patients before, eight hours after, and 16 hours after percutaneous intervention.
Patients with ST-elevation myocardial infarction showed a significant increase in miR-499 levels compared to patients with stable coronary artery disease. Once mastered, this technique can be done in about an hour for droplet formation of 96 samples if it is done correctly. While attempting this procedure, it is important to keep in mind to handle the droplets with care.
After watching this video, you should have a good understanding of how to perform digital PCR correctly, by correct droplet formation, cycling, reading, and analyzing.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor de extractie en kwantificering van circulerende microRNA's als potentiële biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen. Door gebruik te maken van digitale PCR, beoogt de methode de nauwkeurigheid van miRNA-meting in serummonsters van patiënten met cardiovasculaire aandoeningen te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cardiovasculaire ziekte
- Biomarkers
- MicroRNA-analyse
Achtergrond
- MicroRNA's zijn kleine niet-coderende RNA's die betrokken zijn bij genexpressie.
- Ze zijn opgekomen als potentiële biomarkers voor verschillende ziekten, inclusief cardiovasculaire aandoeningen.
- Digitale PCR biedt voordelen ten opzichte van traditionele methoden voor het kwantificeren van microRNA's.
- Het begrijpen van miRNA-profielen kan helpen bij de diagnose en behandeling van cardiovasculaire ziekten.
Doel van het onderzoek
- Om microRNA's te valideren als biomarkers voor cardiovasculaire ziekten.
- Om de effectiviteit van digitale PCR in het kwantificeren van circulerende miRNA's aan te tonen.
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor onderzoekers op het gebied.
Gebruikte methoden
- Extractie van miRNA's uit serummonsters.
- Omgekeerde transcriptie om complementair DNA te synthetiseren.
- Digitale PCR voor absolute kwantificering van miRNA's.
- Vergelijking van digitale PCR met kwantitatieve real-time PCR.
Belangrijkste resultaten
- Digitale PCR toonde superieure nauwkeurigheid in miRNA-kwantificering.
- De methode maakt de analyse van duizenden druppels mogelijk zonder de noodzaak van standaardcurven.
- De potentiële toepasbaarheid van de methode strekt zich uit tot voorbij cardiovasculaire ziekten naar andere aandoeningen zoals kanker.
- Uitdagingen bij het hanteren van fragiele druppels werden opgemerkt voor nieuwe gebruikers van de techniek.
Conclusies
- De studie ondersteunt het gebruik van circulerende microRNA's als biomarkers voor cardiovasculaire ziekten.
- Digitale PCR is een veelbelovend hulpmiddel voor nauwkeurige miRNA-kwantificering.
- Verder onderzoek zou de toepassing van deze methode kunnen uitbreiden naar andere ziekten.
