En anaerob Biosensor analysen for påvisning av kvikksølv og kadmium

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om biogeokjemisk sykling av kadmium og kvikksølv som hvordan ulike miljøvariabler påvirker deres biotilgjengelighet til bakterier. Den største fordelen med denne teknikken er at den tilbyr kvasi sanntidbiotilgjengelighetsdata og levedyktige celler uavhengig av tilstedeværelsen av oksygen. Vanligvis enkeltpersoner nye til denne metoden vil slite fordi det er mange tid følsomme skritt som krever svært omhyggelig oppmerksomhet på detaljer.

Å demonstrere prosedyren vil være Ben, en grad student fra laboratoriet mitt. For å forberede analysen, hent kvikksølvinduserbar biosensor og den konstituerende uttrykte biosensoren fra en minus 80 grader Celsius cryo lager. Plate cellene på Lysogeny kjøttkraft plater som inneholder 120 mikrogram per milliliter ampicillin.

Dyrke platekulturene i en inkubator ved 37 grader Celsius over natten. Mellom 4:30 og 5 p.m. inokulerer en kultur i ti milliliter LB med ampicillin og vokse over natten på 37 grader Celsius med risting på 220 rpm.

På mellom ni og ti .m neste morgen bringe kulturen samt tidligere forberedt vekstmedium inn i anaerob kammeret. Deretter legger du til åtte milliliter frisk vekst medium og 210 mikrogram per milliliter ampicillin i en steril balch tube.

Samle nå to milliliter av den voksne kulturen over natten og overfør til et to milliliter mikro sentrifugerør. Etter sentrifugering på 10, 000 RCF i 90 sekunder, fjerne supernatant og resuspend i to milliliter av frisk vekst medium. Deretter legger du til den gjenbrukte kulturen til balch-røret som inneholder åtte milliliter frisk vekstmedium og ampicillin.

Bruk steril teknikk, legg forsiktig en gummipropp på balchrøret før du fjerner den fra det anaerobe kammeret. Plasser deretter røret i en inkubator og vokse anaerobically ved 37 grader Celsius med risting på 220 rpm. Mellom tre og fem .m.

bringe balch røret med kulturen, en ny steril balch tube, og vekstmediet inn i anaerob kammeret. Tilsett 100 mikroliter av kulturen til 10 milliliter frisk vekstmedium med ampicillin i det sterile balchrøret. Bruk steril teknikk, legg forsiktig en gummipropp på ballerøret.

Fjern røret fra det anaerobe kammeret før du vokser det over natten ved 37 grader Celsius med risting ved 220 o/min. Mellom ni og ti .m neste dag, overføre kulturen og vekstmediet tilbake til det anaerobe kammeret.

Igjen legge åtte milliliter vekst medium og ampicillin i en steril balch tube. Overfør to milliliter av den voksne kulturen over natten til et to milliliter mikro sentrifugerør. Etter sentrifugering som før, fjern de overnaturante og gjenoppuspend cellene i to milliliter med frisk vekstmedium.

Tilsett deretter den gjenbrukte kulturen til balchrøret som inneholder det friske vekstmediet og ampicillin. Bruk steril teknikk, legg forsiktig en gummipropp på ballerøret. Fjern den fra kammeret og vokse anaerobically ved 37 grader Celsius med risting på 220 rpm.

Overvåk kulturens vekst ved hjelp av et spektrofotometer ved å virvle kulturen og deretter måle den optiske tettheten ved 600 nanometer eller OD600. Etter tre til fire timer med forventet vekst, bør kulturen nå en OD600 på 6. Ta nå røret i det anaerobe kammeret og overfør kulturen til to to milliliter mikro sentrifugerør.

Etter sentrifugering som før fjerne supernatant og resuspend hver celle gane i to milliliter av frisk eksponering medium. Gjenta dette vasketrinnet én gang for å fjerne spor av vekstmediet. Nå kombinerer du begge mikro sentrifugerørene av cellekulturen i et syv milliliter PTFE standard hetteglass for å oppnå biosensorlageret for bruk i eksponeringsanalysen.

Før du starter forsøket, må du kontrollere den anaerobe monitoren for å sikre at det ikke er oksygen i det anaerobe kammeret. Design plateoppsettet i henhold til en 96-brønnmal. For å kjøre eksperimenter i tekniske replikeringer av tre vil dette tillate 32 forskjellige behandlinger, som best er representert med et fire og åtte rutenett for å sette opp hetteglassene.

Sett opp de fire og åtte rutenettet i henhold til analyseplateoppsettet. Plasser deretter syv milliliter PTFE standard hetteglass i skuffen. Hetteglass skal kun håndteres ved å manipulere utsiden av hetteglasset.

Tilsett eksponeringsvolumet i hvert hetteglass som tilsvarer hver behandling. Til hvert hetteglass legger du til det tilsvarende volumet av den kjemiske variabelen som skal testes i henhold til plateoppsettet. Legg nå nitrat til hvert hetteglass slik at konsentrasjonen er 200 mikromos.

Ekskluder dette trinnet for konstituerende biosensorbehandling blanks. For å tilsette kvikksølv til hetteglassene, ta først de fire til åtte mikromosebestanden og rist godt. Fortynn oppløsningen og eksponeringsmediet i et syv milliliter PTFE hetteglass til en konsentrasjon på 100 til 250 nanomolar for å lage en fungerende kvikksølvløsning.

Fra denne arbeidsløsningen, tilsett kvikksølv til de nødvendige hetteglassene i henhold til plateoppsettet. Etter å ha lagt kvikksølv eller kadmium manuelt riste platen i en orbital bevegelse. Eksperimentet kan settes på pause nå avhengig av tiden det tar for at kvikksølv eller kadmium skal ses i løsningen.

Når eksperimentet gjenopptas, forsiktig pipette biosensor lager frem og tilbake for å sikre homogenitet. Tilsett deretter 100 mikroliter av biosensorlageret til hvert hetteglass og rist platen manuelt som før. Varm opp plateleseren til 37 grader Celsius og sett opp en kinetisk løp i ti timer med leser hvert to punkt fem til fem minutter.

En orbital risting mellom avlesninger. Sett opp løpet for å ta fluorescensmålinger med en fluorescens eksitasjon på 440 nanometer og et utslipp på 500 nanometer. Nå pipette 200 mikroliter fra hvert PTFE hetteglass i fire og åtte gitter inn i tilsvarende brønner av 96 brønnplaten.

Pipetten frem og tilbake fem ganger før du overfører hver 200 mikroliter. I stedet for å kaste pipettespissen, la pipettespissen stå i PTFE hetteglasset for å holde oversikt over rørsettfremdriften. Plasser 96-brønnplaten i skuffen på plateleseren.

Plasser deretter lokket på 96-brønnplaten og start analysen. Her er representative resultater som viser korrigerte fluorescensdata som en tidsfunksjon. Fluorescens er vist med økende konsentrasjoner av kvikksølv til den induknelige biosensoren.

Alle verdier er tomme for ingen kvikksølvkontroll. De fluorescerende toppene kan kvantifiseres for å vise fluorescerende signal som en funksjon av kvikksølv eller kadmiumkonsentrasjon. For både de indukne og de konstitutive biosensorene bør kvikksølv- eller kadmiumkonsentrasjonen midt i det indukne sensorer lineære området brukes til å teste variabler.

Her er eksempler på et ufullstendig resultat med sink. Og et avgjørende resultat med magnesium og mangan på kvikksølvbiotilgjengelighet til biosensoren. Resultatet med sink er ufullstendig fordi den konstitutive fluorescensen forfaller med induserbar fluorescens som indikerer toksisitet.

Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å gå inn i konsentrasjonene av enten kadmium eller kvikksølv som disse vil bli brukt til å kalibrere biosensor. Etter denne prosedyren kan andre metoder som termodynamisk modellering av vandige systemer utføres for å svare på flere spørsmål som hvordan spesifikke kjemiske arter av kvikksølv eller kadmium påvirker deres biotilgjengelighet. Ikke glem at arbeid med kadmium og kvikksølv og sterke syrer som svovelsyre kan være ekstremt farlig og forholdsregler som bruk av personlig verneutstyr bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen miljømikrobiologi for å utforske kvasi sanntid anaerob kvikksølv eller kadmium biotilgjengelighet og genetisk tractable mikrober.