Høy gjennomstrømming-måling av Plasma membran Resealing effektivitet i pattedyrceller

Denne analysen ble utviklet for å løse viktige spørsmål innen plasmamembranbiologi og for å fastslå hvor effektivt skadede celler kan reseal deres plasmamembran. Denne teknikken kan brukes til å måle effektiviteten av plasmamembranen ettersegling i en høy gjennomstrømningskapasitet og for å identifisere spesifikke proteiner og tilsvarende veier som medierer plasmamembranen ettersegling. Begynn med å legge til 20 milliliter av en 2,5 ganger 10 til de femte HeLa-cellene per milliliter vekstmediumsuspensjon i et sterilt pipettebasseng og bruk en 10 milliliter serologisk pipette til å blande cellene grundig.

Deretter bruker du en flerkanals mikropipette til å frø 100 mikroliter celler per brønn i triplikate i en 96-brønns flat, klar bunn, svart polystyrenvevskultur behandlet plate. Husk at en homogen cellefordeling er nøkkelen til et vellykket eksperiment, da sammenligninger mellom alle eksperimentelle forhold krever tilsvarende celletellinger. Etter 24 timer i den fuktede cellekulturinkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% CO2, førvarme plateleseren til 37 grader Celsius og sett den optiske konfigurasjonen til monokromator, lesemodus til fluorescens og lesetypen til kinetisk.

Under bølgelengdeinnstillingene velger du en ni nanometer eksitasjon og en 15 nanometer utslippsbåndpass. For analyser ved hjelp av propidiumjodid, sett eksitasjons- og utslippsbølgelengdene til henholdsvis 535 nanometer og 617 nanometer. Under platetype velger du 96-brønner for plateformatet, og velger en forhåndsinnstilt platekonfigurasjon som tilsvarer en svart vegg klar bunnplate.

Under leseområdet, markere brønnene som vil bli analysert gjennom kinetisk analyse. Under PMT og optikk forhåndsinnstiller du blitsene per leses til seks og merker av i boksen for lesing fra bunnen. Under timing angir du null timer 30 minutter og null sekunder inn i den totale kjøretiden for en 30 minutters kinetisk analyse og angir null timer fem minutter og null sekunder for intervallet.

Bekreft de angitte innstillingene i innstillingsinformasjonen, og klikk OK. Klikk deretter lese for å starte kinetisk kjøre. Hvis du vil angi bildeparametrene i innstillingsmodus, angir du MiniMax for den optiske konfigurasjonen, bildebehandlingen for lesemodus og endepunktet for lesetypen. Under bølgelengder velger du overført lys og de aktuelle fluorescensboksene som tilsvarer de eksperimentelle eksitasjons- og utslippsbølgelengdene.

Still inn platetypen og leseområdet som nettopp demonstrert, og under brønnområdeinnstillingen angir du antall nettsteder i en brønn som skal avbildes. Under innstillingene for bildeanskaffelse for GFP setter du enheten til å bilde hele brønnen med en eksponeringstid på 20 millisekunder per bilde. For overført lys, få et enkelt bilde av midten av hver brønn med en åtte millisekund eksponeringstid.

For propidiumjodid, få et enkelt bilde i midten av hver brønn med en 20 millisekund eksponeringstid. Bekreft deretter innstillingene i innstillingsinformasjonen og klikk OK og les for å starte bildet. For å sette opp en høy gjennomstrømningsfluorescensbasert analyse for reparasjonspermissive forhold, vask cellene to ganger med 200 mikroliter på 37 grader Celsius M1 medium per brønn og tilsett 100 mikroliter frisk 37 grader Celsius M1 medium supplert med 30 mikromospropidiumjodidiumjodid etter å ha kastet den andre vasken.

For reparasjon restriktive forhold, vaske cellene en gang med 200 mikroliter på 37 grader Celsius M2 medium supplert med fem millimolar EGTA per brønn etterfulgt av en vask med 200 mikroliter M2 medium alene. Etter å ha kastet den andre vasken, tilsett 100 mikroliter frisk 37 grader Celsius M2 medium supplert med 30 mikromolarpropidiumjodid per brønn. Deretter bilde platen under overført lys, GFP, og PI som nettopp demonstrert.

Mens platen blir avbildet, plasser en 96 godt rund bunnmikroplate i polypropylen på isen og konfigurer platen som vist for den forrige platen. For reparasjonspermissive forhold, tilsett 100 mikroliter iskalde M1 medium supplert med 60 mikromolarpropidiumjodid per brønn etterfulgt av tillegg av 100 mikroliter iskald m1 med eller uten 4X listeriolysin O per brønn. For reparasjons restriktive forhold, tilsett 100 mikroliter iskalde M2 medium supplert med 60 mikromolar propidiumjodid per brønn etterfulgt av tillegg av 100 mikroliter iskalde M2 med eller uten 4X listeriolysin O per brønn.

Det er viktig å forberede listeriolysin O ved riktig eksperimentell konsentrasjon på is omtrent fem minutter før starten av den kinetiske analysen når plate en er på is og plate to blir forberedt. Når den første platen er ferdig med bildebehandling, umiddelbart overføre platen på et ark med aluminiumsfolie på is. Etter fem minutter overfører du 100 mikroliter fra hver brønn av den andre platen til riktig tilsvarende brønn i den første avkjølte platen, og setter inn pipettespissene under menisken av løsningen i hver brønn før du kaster ut volumet uten å blande for riktig fordeling av toksinet.

La toksinet binde seg til vertscellene i ett minutt og overfør umiddelbart den første platen til plateleseren for den postkinetiske analysen ved hjelp av spektrfluorometermodus. På slutten av den kinetiske analysen får du umiddelbart en post-kinetisk bildebehandling av platebildet som demonstrert for den pre-kinetiske bildebehandlingen. Hvis du vil fastslå celleantallet basert på kjernefysisk fluorescens, velger du diskret objektanalyse ved hjelp av 541 som bølgelengde for å finne objekter i innstillingene for mikroplateceller under innstillinger.

I alternativet søk etter objekter bruker du tegnemetoden for å finne bilder, velger kjerner og klikker bruk, og deretter klikker du OK og leser for å starte celletellingsalgoritmen. GFP-uttrykk forstyrrer ikke propidiumjodidintensitetsmålinger i nærvær eller fravær av listeriolysin O-behandling. Uttrykket for propidiumjodid kan blø gjennom GFP fluorescens som det fremgår av en økning i GFP fluorescensintensiteten i HeLA H2B-GFP-celler i post-kinetisk bildeanalyse sammenlignet med den pre-kinetiske analysen.

Viktigere, dette crossover påvirker ikke celletelling, som segmenteringsprosessen involvert i opplisting av kjernene er upåvirket av en økning i GFP fluorescens. I fravær av listeriolysin O forblir plasmamembranintegriteten konstant i nærvær eller fravær av ekstracellulær kalsium, mens listeriolysin O-behandling i nærvær av kalsiumsupplert medium resulterer i en jevn økning i propidiumjodidfluorescensintensitet. I fravær av ekstracellulær kalsium er det imidlertid en betydelig brattere økning i propidiumjodidfluorescens, noe som reflekterer fraværet av membran resealing.

Alternativt kan en karboocyaninkjernesyrebindende fargestoff med fluorescens i det fjerne røde erstattes for propidiumjodid for å minimere spektral overlapping med GFP. I tillegg viser den større eksitasjonskoeffisienten for det langt røde fargestoffet et høyere signal-til-støy-forhold og en bedre oppløsning mellom reparasjonspermissive og reparere restriktive forhold. Mens du prøver denne prosedyren, anbefales det å merke alle rørene en dag før eksperimentet, da dette vil forberede deg på alt reagenspreparatet på eksperimentdagen.

Etter denne prosedyren kan andre metoder som bildecytometri utføres for å svare på flere spørsmål, for eksempel skader en pore forming toksin alle celler jevnt eller er noen celler mer utsatt enn andre. Etter utviklingen har denne teknikken banet vei for forskere innen smittsom sykdom og plasmamembranreparasjon for å utforske effekten av porestørrelse på reparasjonseffektiviteten til forskjellige celletyper.