Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Hög genomströmning mätning av plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller
Chapters
Summary January 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här beskriver vi en hög genomströmning fluorescens-baserad analys som mäter plasmamembranet återförslutning effektivitet genom fluorometric och imaging analyser i levande celler. Denna analys kan användas för screening droger eller målgener som reglerar plasmamembranet återförslutning i däggdjursceller.
Transcript
Denna analys utvecklades för att ta itu med viktiga frågor inom området plasmamembranbiologi och för att fastställa hur effektivt skadade celler kan återförsluta sitt plasmamembran. Denna teknik kan användas för att mäta effektiviteten i plasmamembran återförslutning i en hög genomströmning kapacitet och att identifiera specifika proteiner och motsvarande vägar som förmedlar plasmamembran återförslutning. Börja med att lägga till 20 milliliter av en 2,5 gånger 10 till den femte HeLa celler per milliliter tillväxt medium suspension i en steril pipett bassäng och använda en 10 milliliter serologisk pipett för att grundligt blanda cellerna.
Därefter använder en flerkanalig mikropipette för att så 100 mikroliter celler per brunn i tre exemplar i en 96-väl platt, klar botten, svart polystyren vävnad kultur behandlad platta. Kom ihåg att en homogen cellfördelning är nyckeln till ett lyckat experiment då jämförelser mellan alla försöksförhållanden kräver likvärdiga cellantal. Efter 24 timmar i den befuktade cellkultur inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5%CO2, förvam plattan läsaren till 37 grader Celsius och ställa in den optiska konfigurationen till monokromator, läsläget till fluorescens, och lästyp till kinetic.
Under våglängdsinställningarna väljer du en nio nanometerexcitation och en 15 nanometerutsläppsbandpass. För analyser som använder propidium-iodid, ställ excitations- och emissionsvåglängderna till 535 nanometer respektive 617 nanometer. Under plåttyp väljer du 96-brunnar för plattans format, och väljer en förinställd skyltkonfiguration som motsvarar en svart vägg klar bottenplatta.
Under läsområdet, belysa de brunnar som kommer att analyseras i hela den kinetiska analysen. Under PMT och optik, förinställda blinkar per läst till sex och markera rutan för läsning från botten. Under tidtagning anger du noll timmar 30 minuter och noll sekunder in i den totala körtiden för en 30 minuters kinetisk analys och anger noll timmar fem minuter och noll sekunder för intervallet.
Bekräfta de angivna inställningarna i inställningsinformationen och klicka på OK. Klicka sedan på läs för att initiera den kinetiska körningen. Om du vill ställa in avbildningsparametrarna inom inställningsläget ställer du in MiniMax för den optiska konfigurationen, avbildning för läsläget och slutpunkten för lästypen. Under våglängder väljer du överfört ljus och lämpliga fluorescenslådor som motsvarar de experimentella excitations- och emissionsvåglängderna.
Ställ in plattan typ och läsområdet som just visat och under väl område inställning, ställa in antalet platser inom en brunn som ska avbildas. Under bildförvärvsinställningarna för GFP ställer du in enheten på att avbilda hela brunnen med en exponeringstid på 20 millisekunder per bild. För överfört ljus, skaffa en enda bild av mitten av varje brunn med en åtta millisekunder exponeringstid.
För propidium iodid, förvärva en enda bild i centrum av varje brunn med en 20 millisekunder exponeringstid. Bekräfta sedan inställningarna i inställningsinformationen och klicka på OK och läs för att initiera bildåtergivningen. För att ställa in en hög genomströmning fluorescensbaserad analys för reparationen tillåtande förhållanden, tvätta cellerna två gånger med 200 mikroliter av 37 grader Celsius M1 medium per brunn och tillsätt 100 mikroliter av färska 37 grader Celsius M1 medium kompletteras med 30 mikromolar propidium jodid efter att kassera den andra tvätten.
För reparation restriktiva förhållanden, tvätta cellerna en gång med 200 mikroliter av 37 grad Celsius M2 medium kompletteras med fem millimolar EGTA per väl följt av en tvätt med 200 mikroliter av M2 medium ensam. Efter att ha kasserat den andra tvätten, tillsätt 100 mikroliter av färska 37 grader Celsius M2 medium kompletterat med 30 mikromolar propidium jodid per brunn. Sedan bild plattan under överfört ljus, GFP och PI som bara visat.
Medan plattan avbildas, placera en 96 väl rund botten polypropylen mikroplatta på is och konfigurera plattan som bara visat för den tidigare plattan. För reparation tillåtande villkor, tillsätt 100 mikroliter av iskallT M1 medium kompletteras med 60 mikromolar propidiumjodid per väl följt av tillägg av 100 mikroliter iskall M1 med eller utan 4X listeriolysin O per brunn. För reparation restriktiva villkor, tillsätt 100 mikroliter iskall M2 medium kompletteras med 60 mikromolar propidiumjodid per väl följt av tillsats av 100 mikroliter iskall M2 med eller utan 4X listeriolysin O per brunn.
Det är absolut nödvändigt att förbereda listeriolysin O vid lämplig experimentell koncentration på is cirka fem minuter före starten av den kinetiska analysen när plattan en är på is och platta två förbereds. När den första plattan är klar bildbehandling, omedelbart överföra plattan på ett ark aluminiumfolie på is. Efter fem minuter, överför 100 mikroliter från varje brunn av den andra plattan till lämplig motsvarande brunn i den första kylda plattan, sätta pipettspetsarna under menisken av lösning i varje brunn i varje brunn innan du matar ut volymen utan att blanda för korrekt fördelning av toxinet.
Låt toxinet binda till värdcellerna under en minut och överför omedelbart den första plattan till plattans läsare för den postkinetiska analysen med hjälp av spektrofluorometerläget. I slutet av den kinetiska analysen, omedelbart förvärva en post-kinetic bildframställning av plattan bilden som visats för den pre-kinetiska imaging. För att bestämma cellantalet baserat på den nukleära fluorescensen, i programvaran mikroplatecelluppräkning under inställningar, välj ny analys och i bildanalysinställningarna, välj diskret objektanalys med hjälp av 541 som våglängd för att hitta objekt.
Inom alternativet hitta objekt, använd rita på bilder hitta metod, välj atomkärnor och klicka på tillämpa, klicka sedan på OK och läsa för att initiera cellräkning algoritm. GFP uttryck inte stör propidiumjodid intensitet mätningar i närvaro eller frånvaro av listeriolysin O behandling. Uttrycket av propidiumjodid kan blöda genom GFP fluorescens som framgår av en ökning av GFP fluorescens intensitet i HeLA H2B-GFP celler i post-kinetic imaging analysen jämfört med den pre-kinetic analysen.
Viktigt dock, denna crossover påverkar inte cellräkning, som segmentering processen som deltar i uppräkningen av atomkärnor är opåverkad av en ökning av GFP fluorescens. I avsaknad av listeriolysin O förblir plasmamembranets integritet konstant i närvaro eller frånvaro av extracellulärt kalcium, medan listeriolysin O-behandling i närvaro av kalcium kompletterat medium resulterar i en stadig ökning av propidiumjodidfluorescensintensiteten. I avsaknad av extracellulära kalcium dock en betydligt brantare ökning av propidium iodide fluorescens, vilket återspeglar frånvaron av membran återförslutning.
Alternativt kan en karbicyanin nukleinsyra bindande färgämne med fluorescens i den långt röda ersättas med propidium iodide att minimera spektral överlappning med GFP. Dessutom uppvisar den större excitationskoefficienten för det långt röda färgämnet en högre signal till brusförhållande och en bättre upplösning mellan reparationen som är tillåtande och reparerar restriktiva villkor. Medan du försöker detta förfarande, Det rekommenderas att märka alla rör en dag före experiment, eftersom detta kommer att förbereda dig för alla reagens beredning på dagen för experimentet.
Efter denna procedur, andra metoder som bild cytometri kan utföras för att svara på ytterligare frågor, såsom gör en porformning toxin skada alla celler enhetligt eller är vissa celler mer mottagliga än andra. Efter dess utveckling har denna teknik banat väg för forskare inom områdena infektionssjukdomar och plasmamembran reparation att utforska effekterna av porstorlek på reparation effektivitet olika celltyper.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
