Neuroscience
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Summary June 19th, 2019
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यहाँ, हम चूहों में नींद / जागना राज्यों की निगरानी के दौरान न्यूरॉन्स के विशेष प्रकार के optogenetic हेरफेर के तरीकों का वर्णन, एक उदाहरण के रूप में stria टर्मिनलिस के बिस्तर नाभिक पर हमारे हाल ही में काम पेश.
Transcript
यह प्रक्रिया हमें विशिष्ट न्यूरो सर्किट के कार्य की पहचान करने में मदद कर सकती है जो कम आक्रामक हेरफेर और उच्च लौकिक संकल्प के साथ नींद जागने विनियमन में शामिल हैं। यह विधि हमें सर्किट और नींद जागना राज्यों के बीच कारण संबंध की जांच करने के लिए एक विशिष्ट न्यूरो सर्किट के हेरफेर के साथ संयोजन के रूप में वास्तविक समय में सतह ईईजी की निगरानी की अनुमति देता है। शोटा कोडनी प्रक्रिया का प्रदर्शन करने जा रहा है ।
पैर की अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, जानवर की आंखों पर मरहम लागू करें और एक शोषक पैड पर एनेस्थेटाइज्ड माउस के सिर को स्थिर करने के लिए स्टीरियोटैक्टिक उपकरण पर कान की सलाखों और नाक पिन का उपयोग करें। जब सिर स्थिति में तय हो जाए, तो खोपड़ी में एक मध्य-धनु चीरा लगाएं ताकि यह पुष्टि हो सके कि सुतुरा सागितलिस और सुतुरा कोरोनालिस या सुतुरा लैम्बडिओडिया के बीच का चौराहा उसी स्तर पर क्षैतिज रेखा में है। पोजिशनिंग गैप से बचने के लिए, नाक चुटकी और कान की सलाखों को आवश्यक के रूप में समायोजित करें।
फिर सेराफिन क्लैंप का उपयोग करके त्वचा को पकड़ने के लिए खोपड़ी की उजागर सतह को खुला कीटाणुरहित करें ताकि कपाल टांके को अधिक स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सके। एडेनो से जुड़े वायरस वेक्टर को इंजेक्ट करने के लिए, खनिज तेल के दो माइक्रोलीटर के साथ एक इथेनॉल निष्फल 10 मिलीलीटर सिरिंज लोड करें, जिसके बाद वायरस की प्रायोगिक मात्रा को इंजेक्ट किया जा सके । माइक्रोइंजेक्शन पंप का उपयोग ब्रेग्मा पर माइक्रोइंजेक्शन सुई की नोक को समायोजित करने के लिए और मूल बिंदु के रूप में निर्देशांक नोट करें।
फिर टिप को निर्धारित इंजेक्शन साइट पर ले जाएं और सुई की नोक को स्थिति पर रखें। इंजेक्शन साइट पर खोपड़ी को चिह्नित करें और खोपड़ी में लगभग दो मिलीमीटर व्यास छेद ड्रिल करने के लिए 0.7 मिलीमीटर कार्बाइड कटर से लैस दंत ड्रिल का उपयोग करें। एक कपास झाड़ू के साथ छेद के आसपास से रक्त को हटाने के बाद, धीरे-धीरे सुई को स्ट्रारिया टर्मिनलिस या बीएसएनटी के बिस्तर नाभिक में ले जाएं और धीरे-धीरे वायरस समाधान की नामित मात्रा को इंजेक्ट करें।
फिर सुई को ध्यान से वापस लेने से पहले BNST ऊतक में पर्याप्त रूप से घुसपैठ करने के लिए समाधान की अनुमति देने के लिए पांच मिनट के लिए सुई को पांच मिनट के लिए छोड़ दें। इलेक्ट्रोएंसेफेलोग्राम, या ईईजी, और इलेक्ट्रोमायोग्राम, या ईएमजी, इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण के लिए, पहला मिलाप दो स्टेनलेस स्टील के तारों से जो एक मिलीमीटर इन्सुलेशन दोनों सिरों से ईएमजी इलेक्ट्रोड के लिए छीन लिया गया है और इलेक्ट्रोड के केंद्र को ब्रेग्मा पर रखें। फिर प्रत्येक ईईजी इलेक्ट्रोड के लिए स्थिति को चिह्नित करें।
ऑप्टिकल फाइबर प्रत्यारोपण की स्थिति निर्धारित करने के लिए, जोड़तोड़ के लिए एक ऑप्टिक फाइबर फेरुल संलग्न करें और एक क्षैतिज लाइन के खिलाफ एक प्लस या माइनस 30 डिग्री कोण के लिए जोड़तोड़ हाथ घुमाएँ । ब्रेग्मा पर फाइबर टिप रखें और निर्देशांक रिकॉर्ड करें। लक्षित प्रविष्टि लाइन के लिए टिप ले जाएँ और खोपड़ी पर स्थिति और प्रविष्टि साइट के बगल में लंगर पेंच के लिए स्थिति को चिह्नित करें।
प्रत्येक साइट पर खोपड़ी ड्रिल करने के लिए दंत ड्रिल का उपयोग करें और धीरे ऑप्टिक फाइबर डालने के लिए जोड़तोड़ का उपयोग करें जब तक यह BNST के ऊपर पहुंचता है । फेरुल को शेष कपाल पर आराम करना चाहिए। एक लंगर पेंच के साथ खोपड़ी के लिए फाइबर सुरक्षित, दुरा को तोड़ने या किसी भी ऊतक को नुकसान नहीं ध्यान रखते हुए।
फिर फोटो-इलाज योग्य दंत सीमेंट के साथ फाइबर और स्क्रू को कवर करें। इसके बाद, ईईजी/ईएमजी इलेक्ट्रोड के लिए ड्रिल होल और एक छेद में पहले इलेक्ट्रोड की नोक डालें । एक हाथ से प्रत्यारोपण पकड़े, खोपड़ी और इलेक्ट्रोड के बीच अंतरिक्ष के लिए साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला लागू होते हैं और इलेक्ट्रोड को बाकी तरह से डालें, जिससे किसी भी ऊतक को नुकसान न हो।
जब सभी इलेक्ट्रोड रखे गए हैं, तो इलेक्ट्रोड और ऑप्टिक फाइबर की परिधि को अतिरिक्त साइनोक्रिलेट चिपकने वाले और साइनोक्रिलेट एक्सीलेंट के साथ कवर करें ताकि फेर्यूल में ऑप्टिक केबल और इलेक्ट्रोड को लीड वायर कनेक्टिंग ज़ोन के लिए कोई रुकावट पैदा करने से बचा जा सके। अब गर्दन की मांसपेशियों को बेनकाब करें, और मांसपेशियों के नीचे ईएमजी इलेक्ट्रोड के लिए तारों को डालें। ईएमजी इलेक्ट्रोड की लंबाई को समायोजित करें ताकि यह नुचल मांसपेशियों के नीचे फिट हो और प्रत्यारोपण को अधिक साइनोक्रिलेट चिपकने वाला और एक्सीलेंट से भर सके।
फिर माउस को पूर्ण क्षतिपूर्ति तक निगरानी के साथ एक हीट पैड पर रखें। लक्षित न्यूरॉन्स की फोटो-उत्तेजन के दौरान ईईजी/ईएमजी निगरानी के लिए, पहले लेजर तीव्रता को समायोजित करने के लिए एक स्केलर का उपयोग करें और लेजर केबल की नोक को अप्रयुक्त ऑप्टिक फाइबर तक सीमित करने के लिए एक फेरुल का उपयोग करें। पुष्टि करें कि फाइबर और केबल के बीच जंक्शन पर कोई जगह नहीं है।
20 मिनट के बाद, तीव्रता चेकर के लिए गरम लेजर उत्सर्जन और 10 मिलीमीटर चुकता प्रति मिलीवाट करने के लिए तीव्रता समायोजित करें । प्रकाश पल्स अवधि को 10 मिलीसेकंड, बाकी अवधि 40 मिलीसेकंड, चक्र को 20 और दोहराने के लिए 20 निर्धारित करें। ट्रांजिस्टर लॉजिक में लेजर मोड बदलें और इस बात की पुष्टि करें कि पैटर्न रेगुलेटर द्वारा नियंत्रित फाइबर से हल्की दालें उत्सर्जित होती हैं।
प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड और केबल एडाप्टर कनेक्ट करें, फिर लेजर रिसाव को रोकने के लिए जंक्शन को हल्के अभेद्य सामग्री से कवर करें। और जब लेजर तैयार है, ईईजी/EMG रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोगात्मक कक्ष में चूहों ले जाएँ। गैर रैपिड आई मूवमेंट या रैपिड आई मूवमेंट स्लीप से जागने के लिए विलंबता का आकलन करने के लिए, रिकॉर्डिंग समय और अनुकूलित साइट लाभ समय को सीमित करें और चूहों को कम से कम एक घंटे के लिए प्रयोगात्मक कक्ष में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करें।
प्रायोगिक अवधि के दौरान, एक ही रिकॉर्डिंग स्क्रीन में ईईजी और ईएमजी संकेतों की निगरानी करें। प्रत्येक राज्य को अलग करने में आसानी के लिए प्रत्येक तरंग के लिए लाभ नियंत्रण का उपयोग करके जागना, गैर रैपिड आई मूवमेंट स्लीप, या रैपिड आई मूवमेंट स्लीप के रूप में माउस की स्थिति का मूल्यांकन करें। गैर रैपिड आई मूवमेंट नींद के मापन के लिए जागना विलंबता के लिए, 40 सेकंड के लिए स्थिर गैर रैपिड आई मूवमेंट नींद का निरीक्षण करें, फिर फोटो उत्तेजना के लिए पैटर्न जनरेटर चालू करें और प्रत्यारोपित ऑप्टिक फाइबर में लेजर उत्सर्जन की पुष्टि करें।
फिर ईईजी/ईएमजी संकेतों को तब तक रिकॉर्ड करें जब तक कि नींद की स्थिति जागने में बदल न जाए। यहां गैर रैपिड आई मूवमेंट स्लीप के दौरान फोटो उत्तेजना से पहले और बाद में ईईजी/ईएमजी निशान दिखाए जाते हैं । कोई ईएमजी संकेतों के साथ एक उच्च वोल्टेज और धीमी आवृत्ति ईईजी, गैर रैपिड आई मूवमेंट नींद का प्रतिनिधित्व करता है।
फोटो उत्तेजना ने चैनलरोडोप्सिन-2 में उत्तेजना के बाद दो सेकंड के बारे में जागने के लिए एक तीव्र संक्रमण शुरू कर दिया, जबकि नियंत्रण चूहों ने इस संक्रमण को प्रदर्शित नहीं किया, सुझाव दिया कि गैर रैपिड आई मूवमेंट नींद के दौरान BNST गाबा न्यूरॉन्स की उत्तेजना जागना के तेजी से प्रेरण से प्रेरित होती है। इसके विपरीत, तेजी से आंख आंदोलन नींद के दौरान फोटो उत्तेजना कोई प्रभाव नहीं था तो एक संक्रमण प्रभाव केवल गैर तेजी से आंख आंदोलन नींद में उभरा । वायरस इंजेक्शन और ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण चरणों के लिए सटीक समन्वय का ध्यान रखना महत्वपूर्ण है।
नींद विश्लेषण के दौरान कब्जा कर लिया EEG/EMG निशान चूहों में विभिंन सतर्क राज्यों पर तस्वीर हेरफेर के परिणामों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तकनीक से हमें नींद जागने वाले राज्यों को विनियमित करने में शामिल अन्य घटकों और सर्किटों की पहचान करने में भी मदद मिलेगी । आंखों को लेजर क्षति से बचने के लिए सुरक्षात्मक चश्मे का उपयोग करें और उपयोग के बाद हमेशा एडेनो से जुड़े वायरस वेक्टर कंटेनर को स्टरलाइज करना सुनिश्चित करें।
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