Login processing...

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Neuroscience

Optogenetic manipulasjon av Neural kretser under overvåking søvn/våkenhet States i mus

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Journal (Neuroscience)

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Journal (Neuroscience)

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Click here for the English version

Optogenetic manipulasjon av Neural kretser under overvåking søvn/våkenhet States i mus

Article DOI: 10.3791/58613-v

June 19th, 2019 •

Shota Kodani*¹, Shingo Soya*², Takeshi Sakurai^2,3

¹Department of Molecular Neuroscience and Integrative Physiology, Faculty of Medicine, Kanazawa University, ²International Institute for Integrative Sleep Medicine (WPI-IIIS), University of Tsukuba, ³Faculty of Medicine, University of Tsukuba

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

June 19th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Her beskriver vi metoder for optogenetic manipulering av bestemte typer neurons under overvåkning av søvn/våkenhet stater i mus, presentere vårt siste verk på sengen kjernen av stria terminalis som et eksempel.

Transcript

Denne prosedyren kan hjelpe oss med å identifisere funksjonen til spesifikk nevrokrets som er involvert i søvnvåkningreguleringen med mindre invasiv manipulasjon og høy temporal oppløsning. Denne metoden tillater oss overvåking overflaten EEG i sanntid i forbindelse med manipulering av en bestemt nevrokrets for å undersøke årsakssammenheng mellom kretser og søvn våkenhet tilstander. Shota Kodani skal demonstrere prosedyren.

Etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemmen, bruk salve på dyrets øyne og bruk ørestengene og nesepinnen til det stereotaktiske apparatet for å stabilisere hodet på den bedøvede musen på en absorberende pute. Når hodet er festet i posisjon, gjør en mid-sagittal snitt i hodebunnen for å bekrefte at skjæringspunktet mellom sutura sagittalis og sutura coronalis eller sutura lambdoidea er i en horisontal linje på samme nivå. For å unngå et posisjoneringsgap, juster neseklemmen og ørestengene etter behov.

Deretter bruker serafin klemmer til å holde huden åpen desinfisere den eksponerte overflaten av skallen for å gjøre det mulig å visualisere kraniale suturer for å bli visualisert tydeligere. For å injisere den adeno-tilknyttede virusvektoren, last en etanolsterilisert 10 milliliter sprøyte med to mikroliter mineralolje, etterfulgt av det eksperimentelle volumet av virus som skal injiseres. Bruk mikroinjeksjonspumpen til å justere spissen av mikroinjeksjonsnålen på luftmaen og notere koordinatene som opprinnelsessted.

Flytt deretter spissen til det angitte injeksjonsstedet og plasser spissen på nålen på posisjonen. Merk skallen på injeksjonsstedet og bruk en tannbor utstyrt med en 0,7 millimeter karbidkutter for å bore et omtrent to millimeter diameter hull i skallen. Etter å ha fjernet blod fra rundt hullet med en bomullspinne, flytt nålen langsomt til sengekjernen i stria terminalis eller BSNT og sakte injisere det angitte volumet av virusoppløsning.

La deretter nålen være på plass i fem minutter slik at oppløsningen tilstrekkelig infiltrerer BNST-vevet før du forsiktig trekker nålen tilbake. For elektroencefalogram, eller EEG, og elektromyogram, eller EMG, elektrodeimplantasjon, første lodde to rustfritt stål ledninger hvorfra en millimeter isolasjon har blitt strippet fra begge ender til EMG elektroder og plassere midten av elektrodene på bregma. Merk deretter posisjonen for hver EEG-elektrode.

For å bestemme posisjonen til det optiske fiberimplantatet, fest en optisk fiber ferrule til manipulatoren og roter manipulatorarmen til en pluss eller minus 30 graders vinkel mot en horisontal linje. Sett fiberspissen på bregmaen og registrer koordinatene. Flytt spissen til den målrettede innsettingslinjen og merk posisjonen på skallen og posisjonen for ankerskruen ved siden av innsettingsstedet.

Bruk tannboret til å bore skallen på hvert sted og bruk manipulatoren til å forsiktig sette inn optisk fiber til den når over BNST. Ferrule bør hvile på de resterende kraniet. Fest fiberen til skallen med en ankerskrue, vær forsiktig så du ikke bryter duraen eller skade noe vev.

Dekk deretter fiberen og skruen med fotoherdbar tannsement. Deretter borer du hull til EEG/EMG-elektroder og setter spissen av den første elektroden inn i ett hull. Hold implantatet med den ene hånden, påfør cyanoacrylat lim på rommet mellom skallen og elektroden og sett elektroden resten av veien, ta vare på ikke å skade noe vev.

Når alle elektrodene er plassert, dekk omkretsen av elektrodene og optiske fibre med ekstra cyanoacrylate lim og cyanoacrylat akselerator for å unngå å forårsake avbrudd i ferrule til optisk kabel og elektrode til bly wire tilkoblingssoner. Nå utsette nakkemusklene, og sett inn ledningene for EMG elektrode under muskelen. Juster lengden på EMG-elektroden slik at den passer like under nuchalmuskulaturen og fyll implantatene med mer cyanoacrylatlim og akselerator.

Plasser deretter musen på en varmepute med overvåking til full kompensasjon. For EEG/EMG-overvåking under fotoutsøtelse av målrettede nevroner, bruk først en skalar til å justere laserintensiteten og bruke en glød for å tether spissen av laserkabelen til en ubrukt optisk fiber. Kontroller at det ikke er plass i krysset mellom fiberen og kabelen.

Etter 20 minutter avgir den varmede laseren til intensitetskontrollen og justerer intensiteten til 10 milliwatt per millimeter kvadrert. Sett lyspulsvarighetet til 10 millisekunder, hvileperioden til 40 millisekunder, syklusen til 20, og gjenta til 20. Endre lasermodus til transistor logikk og bekrefte at lyspulser slippes ut fra fiberen kontrollert av mønsterregulatoren.

Koble til den implanterte elektroden og kabeladapteren, og dekk deretter krysset med lett ugjennomtrengelig materiale for å forhindre laserlekkasje. Og når laseren er klar, flytt musene til det eksperimentelle kammeret for EEG / EMG-opptak. For å vurdere ventetiden til våkenhet fra ikke-rask øyebevegelse eller rask øyebevegelsessøvn, begrens opptakstiden og optimalisert sted få tid og la musene bevege seg fritt i det eksperimentelle kammeret i minst en time.

I løpet av den eksperimentelle perioden overvåker du EEG- og EMG-signalene i samme opptaksskjerm. Evaluer musens tilstand som våkenhet, ikke rask øyebevegelsessøvn eller rask øyebevegelsessøvn ved hjelp av forsterkningskontroll for hver bølge for enkel å skille mellom hver tilstand. For måling av ikke-rask øyebevegelse søvn til våkenhet ventetid, observere stabil ikke rask øyebevegelse søvn i 40 sekunder, deretter slå på mønsteret generator for fotostimulering og bekrefte laserutslipp til implanterte optiske fibre.

Deretter registrerer du EEG/EMG-signalene til søvntilstanden endres til våkenhet. Her vises det vist EEG/EMG-spor før og etter fotostimulering under ikke-rask øyebevegelsessøvn. En høy spenning og langsom frekvens EEG uten EMG signaler, representerer ikke rask øyebevegelse søvn.

Fotostimulering utløste en akutt overgang til våkenhet omtrent to sekunder etter stimulering i channelrhodopsin-2 som uttrykte mus mens kontrollmus ikke viste denne overgangen, noe som tyder på at eksitasjonen av BNST GABA nevroner under ikke-rask øyebevegelses søvn utløser en rask induksjon av våkenhet. Omvendt hadde fotostimulering under rask øyebevegelsessøvn ingen effekt, så en overgangseffekt dukket bare opp i ikke-rask øyebevegelsessøvn. Det er viktig å ta vare på nøyaktige koordineringer for virusinjeksjon og optisk fiberimplantasjonstrinn.

EEG/EMG-sporene som fanges opp under søvnanalysen, kan brukes til å vurdere konsekvensene av fotomanipulasjonen på de forskjellige årvåkne tilstander hos mus. Denne teknikken vil også hjelpe oss med å identifisere andre komponenter og kretser som er involvert i å regulere søvnvåkning tilstander. Bruk vernebriller for å unngå laserskader på øyet og sørg for å alltid autoklav sterilisere adeno-assosiert virus vektor beholder etter bruk.

X

Simple Hit Counter