Immunology and Infection
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एचआईवी से जुड़े लिवर रोगजनन के लिए दोहरी मानवीकृत टीके-एनओजी माउस मॉडल की स्थापना
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इस प्रोटोकॉल दोनों मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और जिगर की कोशिकाओं के साथ मानवीय चूहों की स्थापना के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है. मानव हेपेटोसाइट्स और सीडी34+ हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं के इंट्रास्प्लेनिक इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त दोहरी पुनर्गठन इम्यूनोन्यूफिडेक्ट चूहों मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस-1 संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और में मनाया के रूप में जिगर की क्षति recapitulate एचआईवी संक्रमित रोगियों।
Transcript
प्रोटोकॉल का समग्र उद्देश्य मानव हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं और हेपेटो साइट का उपयोग करके कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और यकृत के साथ एक मानवीकृत माउस मॉडल उत्पन्न करना है। यह विधि आनुवंशिक जिगर मानवीकृत चूहों में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। यह विधि लोगों में मनाए गए एचआईवी के कारण इम्यूनोपैथोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है।
इस प्रक्रिया का प्रदर्शन पैथोलॉजी और माइक्रोबायोलॉजी विभाग के पर्यवेक्षक यिमिन सन द्वारा किया जाएगा, साथ ही वेमिन वांग और एडवर्ड मकारोव, रिसर्च टेक्नोलॉजिस्ट होंगे । शुरू करने के लिए, हेपरिनाइज्ड ट्यूबों में एकत्र गर्भनाल रक्त को बाँझ लेमिनार प्रवाह कैबिनेट में स्थानांतरित करें। जब तक वॉल्यूम 35 मिलीलीटर तक नहीं बढ़ जाता तब तक पीबीएस जोड़ें।
लिम्फोसाइट सेपरेशन मीडियम के शीर्ष पर नमूना परत और अपकेंद्रित्र यह ४०० बार जी और कोई टूट के साथ ३५ मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर । इसके बाद, शीर्ष प्लाज्मा परत को ध्यान से हटा दें और सफेद बफी कोट इंटरफेस को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें। बर्फ ठंड बफर के 30 से 40 मिलीलीटर में बफी कोट को फिर से निलंबित करें।
एक पिपेट का उपयोग करके, सेल सस्पेंशन के 20 माइक्रोलीटर को 0.4% ट्राइपैन ब्लू के 20 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं। एक गिनती स्लाइड के दो कक्षों में से किसी के बाहरी उद्घाटन में इस मिश्रण के पिपेट 10 माइक्रोलीटर, और कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर में स्लाइड डालें। 300 गुना जी पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर।
ध्यान से सुपरनेट को एस्पिएरेट करें और आइस कोल्ड बफर के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें। मानव एफसी रिसेप्टर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें जो रिएजेंट को अवरुद्ध करते हैं और मोनोक्लोनल माउस एंटी-ह्यूमन सीडी 34 एंटीबॉडी के 100 माइक्रोलीटर 100 मिलियन कोशिकाओं के लिए माइक्रोबीएड को संयोजित करते हैं। चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
कोशिकाओं को धोने के लिए 10 मिलीलीटर बर्फ ठंडे बफर जोड़ें और इसे 300 बार जी और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र करें। ध्यान से सुपरनेट को हटा दें और बर्फ के ठंडे बफर के 500 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। इसके बाद, चुंबकीय सक्रिय सेल छंटाई क्षेत्र में एक सकारात्मक चयन एलएस कॉलम रखें और इसे तीन मिलीलीटर बर्फ ठंडे बफर के साथ पारित करें।
नमूने को एलएस कॉलम में लोड करें जो नमूनों में मानव सीडी 34 सकारात्मक कोशिकाओं से बंधे माइक्रोबीएड को फंसा सकता है, और इसे संग्रह ट्यूब में गुरुत्वाकर्षण के प्रभाव में प्रवाहित करने की अनुमति देता है। कॉलम को बर्फ के ठंडे बफर से तीन बार धोएं और एक ही संग्रह ट्यूब में एल्यूएंट इकट्ठा करें। फिर, एक नए संग्रह ट्यूब में CD34 सकारात्मक कोशिकाओं को दूर करने के लिए बर्फ ठंड बफर के पांच मिलीलीटर के साथ कॉलम डुबकी ।
90% से अधिक की शुद्धता प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया दोहराएं, ट्राइपैन ब्लू डाई और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें ताकि सीडी 34 सकारात्मक कोशिकाओं को गिन सके। गिनती के बाद, पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को त्यागें और प्रत्यारोपण में तुरंत उपयोग किए जाने वाले इंजेक्शन के लिए पीबीएस के 125 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
CD34 पॉजिटिव एल्यूंट की शुद्धता की जांच करने के लिए, निलंबन के 50 माइक्रोलीटर लें और इसे 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर पीई के 10 माइक्रोलीटर के साथ इनक्यूबेट करें। इसके बाद, पीबीएस में कोशिकाओं को धोएं और फिर से निलंबित करें और प्रवाह साइटोमेट्री करने के लिए आगे बढ़ें। अधिग्रहण के बाद, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित डेटा का विश्लेषण करें।
सबसे पहले, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित क्रायोप्रीवित हेपेटोसाइट्स को पुनः प्राप्त करें और पिघलाएं। फिर, बायो कैप को हटा दें और गल गए हेपेटोसाइट्स को 50 मिलीलीटर शंकु नली में डालें जिसमें गर्म विगलन माध्यम होता है। कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए कुछ सेकंड के लिए हाथ से ट्यूब रॉक।
कोशिकाओं को 100 गुना जी और कमरे के तापमान पर आठ मिनट के लिए गोली दें। पीबीएस में 0.1% बीएसए के साथ पेलेट कोशिकाओं को धोएं और उन्हें पीबीएस में ताजा या गल गए एचएसपीसी के साथ प्रति माउस 80 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में पूल करें। सबसे पहले, एक बाँझ विस्तार ट्यूब के एक छोर को 30 गेज सुई और दूसरे छोर को एक मिलीलीटर सिरिंज में संलग्न करें।
पूल्ड एचईपीएस और एचएसपीसी के निलंबन के साथ सिरिंज भरें। एक दोहराव वितरण पिपेट के पायदान में सिरिंज फिट करें और प्रत्येक प्रेस में 10 माइक्रोलीटर बांटने के लिए डिस्पेंसर को समायोजित करें। पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रत्येक माउस को शेव करें और 10% पोविडोन आयोडीन के साथ प्रत्येक माउस के शरीर के बाईं ओर स्क्रब करें 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल का पालन करें।
वैनास प्रकार की कैंची का उपयोग करके, रिब पिंजरे के निचले किनारे के नीचे पेरिटोनियल गुहा में प्रवेश करने के लिए पेरिटोनियल दीवार के बाईं ओर त्वचा, मांसपेशी और पेरिटोनम में एक छोटा सा चीरा बनाएं। तिल्ली का पता लगाएं और इसे आसान पहुंच के लिए ऑपरेटिंग क्षेत्र में थोड़ा खींचने के लिए संदंश का उपयोग करें और तिल्ली के निचले ध्रुव में 30 गेज सुई डालें। इसके बाद, डिस्पेंसिंग पिपेट के प्लंजर को अनलॉक करें और एक बार में वॉल्यूम के 10 माइक्रोलीटर बांटें, जिसमें 60 से 80 माइक्रोलीटर प्रति तिल्ली की सीमा होती है।
सुई को धीरे-धीरे वापस लें और एक लिगाशन एप्लीपर का उपयोग करके लिगाटिंग क्लिप के साथ तिल्ली को क्लिप करें। फिर, तिल्ली को शरीर के गुहा में वापस धकेलने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ गीले कपास-इत्तला वाले एप्लिकेटर का उपयोग करें। पेट की दीवार की मांसपेशियों की परत को बंद करने के लिए एक बाधित सीवन पैटर्न का उपयोग करें।
गैर-अवशोषित टांके का उपयोग करके एक बाधित सीवन पैटर्न के साथ त्वचा बंद करने को पूरा करें। सभी आवश्यक सामग्रियों को एक नामित बायोसेफ्टी लेवल टू प्लस सुविधा में स्थानांतरित करें। वायरस के साथ काम करते समय हर समय कट प्रतिरोधी दस्ताने सहित एक डिस्पोजेबल कवर सभी गाउन, शू कवर, एक फेस मास्क और डबल दस्ताने सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
मानव सीडी 45 सकारात्मक कोशिकाओं के 15% से अधिक के पुनर्गठन के साथ चूहों का चयन करें और एचआईवी-1 संक्रमण के लिए सीरम में मानव एल्बुमिन की उपस्थिति के साथ। इंट्रापेरिटोनेली चूहों को 1, 000 से 10, 000 ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक के साथ 50 एचआईवी-1 एडीए की 100 से 200 माइक्रोलीटर प्रति माउस की मात्रा में इंजेक्ट करता है। चूहों को इच्छामृत्यु के बाद, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रत्येक माउस से यकृत को उत्पादित करें।
रात भर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में यकृत को इकट्ठा करें और ठीक करें। मानव जिगर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ एक दोहरी मानवीकृत माउस मॉडल की स्थापना को क्रमशः बहुत सरल एलिजा और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ प्रत्येक चरण में आसानी से निगरानी की जा सकती है। प्रवाह साइटोमेट्री नियमित रूप से एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास का मूल्यांकन करने और प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर एचआईवी संक्रमण के प्रभाव को देखने के लिए किया जाता है।
दोहरी मानवीकृत चूहों में, कार्यात्मक प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विकास लिम्फोसाइट गेट के 15 से 90% तक हो सकता है। मानव हेपेटोसाइट्स के एनग्रफ्टमेंट के मूल्यांकन के लिए, मानव-विशिष्ट एल्बुमिन स्तरों के लिए एलिजा माउस सीरम पर मासिक किया जाता है। एचएसपीसीएस और एचईपी दोनों के साथ engrafted चूहों मानव विशिष्ट एल्बुमिन का स्तर लगभग सात माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर से लेकर एक महीने में ३७७ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर तक दिखाते हैं, जो अवलोकन के समय में लगातार बढ़ता जा रहा है ।
दोहरी मानवीकृत चूहों के रक्त में मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर एचआईवी संक्रमण के प्रभाव को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा और मानव-विशिष्ट एल्बुमिन एलिजा द्वारा जिगर में एचईपी पर निगरानी की जाती है। पांच सप्ताह तक, एचआईवी-1 सीरम में मानव एल्बुमिन के स्तर में कमी का कारण बनता है और दोहरी मानवीकृत चूहों के जिगर वर्गों में मानव CK18 सकारात्मक हेपेटोसाइट्स की कमी होती है। सीडी 4 से सीडी 8 के अनुपात का कम आमतौर पर एचआईवी संक्रमित चूहों के रक्त और यकृत में देखा जाता है, संक्रमण से पहले एक ही माउस में नोट किए गए स्तरों की तुलना में।
बफी कोट के अलगाव के लिए लिम्फोसाइट पृथक्करण माध्यम के शीर्ष पर रक्त को सावधानीपूर्वक स्तरित किया जाना चाहिए। सर्जरी के लिए, तिल्ली को धीरे-धीरे पकड़ें और तिल्ली के निचले ध्रुव में सुई डालें। हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के बाद, सीडी 34 सकारात्मक हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं की शुद्धता की जांच करना महत्वपूर्ण है ताकि सीडी 3 सकारात्मक कोशिकाओं और विभिन्न दाता से हेपेटोसिटे के तीव्र इंजेक्शन से बचा जा सके।
मानवीकृत चूहों मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और जिगर के शारीरिक पहलू दिखाने के रूप में, विकसित चूहों एचआईवी और शारीरिक संक्रमण और सिरोसिस के फिजियोपैथोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 151 दोहरी मानवीय चूहों एल्बुमिन हेपेटोसाइट्स मानवीकृत यकृत मानव प्रतिरक्षा प्रणाली मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस-1 (एचआईवी-1) हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल हेमेटोपोएटिक जनक कोशिकाएंRelated Videos
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